Dokument: Characterization of the subunits of the γ-secretase complex.

Titel:	Characterization of the subunits of the γ-secretase complex.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40486
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161129-093639-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Yu, Kun [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.11.2016 / geändert 22.11.2016
Beitragende:	Prof.Dr. Labahn, Jörg [Betreuer/Doktorvater] Prof.Dr. Heise,Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The γ-secretase complex is a unique integral membrane protease which carries out the regulated intramembrane proteolysis of over 90 substrates. The structural and functional studies of the γ-secretase complex have been extensively implemented during the past decades. Four major components are well-known to be responsible for the native γ-secretase activity: presenilin, the catalytic core protein; PEN-2, a potential promoter for the presenilin endoproteolysis and a stabiliser for the active presenilin fragments; APH-1, a scaffold protein for the whole γ-secretase complex; and nicastrin, a substrate recognizer. In this study, the four components of γ-secretase were expressed recombinantly from E.coli or insect cell expression system. All four components could be expressed separately and purified successfully in vitro. The cell-free expression system was employed to gain the general information about the properties of each component, as well as the intermolecular interactions. Large-scale protein production was achieved by in vivo cell expression. Optimised expression conditions, solubilization and purification protocols were developed for each individual protein. Three of the four components (presenilin, PEN-2 and nicastrin) were produced using the E.coli cells and purified in FOS-choline detergents with good yields (1-4 mg purified protein per liter cell culture) and high qualities which are suitable for downstream crystallisation application. Expression of APH-1 was achieved from insect cells with a yield of 80 μg purified protein per gram cell pellet. The identity and completeness of the target proteins were verified by both western blotting against the specific affinity tag and mass spectrometry (LS-MS/MS). The oligomer state of each detergent purified protein was characterised to be a dimeric state of PEN-2, a trimer of presenilin, a trimer of APH-1 and tetramer of nicastrin, respectively. Further biophysical characterisation of nicastrin, PEN-2 and presenilin were conducted by CD and fluorescence spectroscopy. All three proteins exhibited a characteristic α-helix dominated secondary structure. Temperature dependent denaturation of the proteins showed a transition from α-helix to β-strand upon heating. The FOS-14 purified nicastrin exhibited 31% helical structure and 23% β-sheet which are in agreement with the secondary structure obtained from the EM structure. The melting temperature obtained from CD measurements suggested a relative heating resistant nicastrin with a Tm of 59 °C in FOS-14. Different FOS-choline detergents did not show much influence on the secondary structure content for PEN-2 and presenilin but altered the thermal stability of both proteins. PEN-2 undergoes a three-step denaturation process in the presence of FOS-14 with an intermediate state between 64-74 °C, and a two-state transition in the presence of FOS-16 with a half-unfolded state at 65 °C. Presenilin 1 protein purified from FOS-14 exhibited a Tm of 47 °C; while FOS-16 purified proteins showed a Tm around 57 °C indicating differences in stability of presenilin 1 in the presence of different detergents. A truncated form of full-length presenilin 1 without the Exon 9 region between TM 6 and TM 7 was designed (DelE9). The thermal stability of DelE9 did not show differences in the presence of different detergents with a Tm value of 56 °C, suggesting the loop regions influence the stability of the presenilin 1-detergent complex. Furthermore, the obtained proteins were subjected to crystallisation trials. Crystallisation conditions were optimised for the first crystals of PEN-2 and nicastrin. The protein crystals were confirmed to contain the respective target proteins by the western blot. Individually expressed and purified presenilin 1 and PEN-2 were reconstituted into liposomes to investigate the in vitro assembly of γ-secretase. The successful insertion of the presenilin 1 and PEN-2 was confirmed by sucrose floating assay as well as re-solubilization in CHAPSO. Co-expression of presenilin and PEN-2 was also achieved using the E.coli BL21 (DE3) strain. Although the enzymatic activity was not obtained from the detergent purified subunits, specific fragmentation of presenilin 1 was observed by co-expressing the two proteins of the catalytic subcomplex, which indicates an activation of the endoproteolytic process of presenilin in the presence of PEN-2. Additionally, the physical interaction between nicastrin and the substrate of γ-secretase, APPC100, was proved by pull-down assays in the presence of detergent, which proves the formation of a substrate binding initiation complex. An apparent dissociation constant in the range of 1-2 μM was determined by microscale thermophoresis. This binding of NCT and APPC100 supports strongly the concept that nicastrin functions as an initial substrate receptor in the γ-secretase complex. Der γ-Sekretase Komplex repräsentiert ein besondere, Membran integrierte Protease, die innerhalb der Membran eine regulierte Proteolyse von über 90 Substraten katalysiert. Während der letzten Dekade wurden extensive Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften dieses Komplexes durchgeführt. Vier Proteine sind für die native γ-Sekretase Aktivität verantwortlich: Presenilin, die katalytische Komponente, PEN-2, der wahrscheinliche Promotor der endoproteolytischen Aktivierung, und Stabilisator der aktiven Presenilinfragmente, APH-1, das Gerüstprotein des Gesamtkomplexes, uns Nicastrin, welches für die Substraterkennung verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden die vier Komponenten des γ-Sekretase Komplex rekombinant exprimiert. Alle vier Komponenten wurden separat exprimiert und erfolgreich gereinigt. . Durch Zellfreie Expression wurde allgemeine Information über die Eigenschaften der Komponenten erhalten, sowie über ihre molekulare Interaktion. Proteinproduktion im größeren Maßstab wurde durch in vivi Expression erreicht. Optimierung der Expressionsbedingungen, Solubilisierung und Reinigungsprotokolle wurden für jedes einzelne Protein separat durchgeführt. Drei der vier Proteine (Presenilin, Pen-2, Nicastrin) wurden in E. coli produziert und in Fos-Cholin mit guter Ausbeute (1-4 mg/L Kultur) und hoher Qualität produziert, welche hinreichend für die Durführung von Kristallisationsexperimenten war. Die Expression von APH-1 wurde in Insektenzellen mit einer Ausbeute von 80 μg gereinigtem Protein pro G Zellen erreicht. Die Identität und Vollständigkeit der Zielproteine wurde durch Western Blot gegen terminale Tags und Massenspektrometry (LS-MS/MS) nachgewiesen. Der Oligomerisierungsstatus der in Detergenz gereinigten Proteine wurde charakterisiert als Dimer für PEN-2, Timer für APH-1 und Presenilin, Tetramer für Nicastrin. Die weitere Charakterisierung der Proteine of Nicastrin, PEN-2 und Presenilin wurde mit Hilfe von CD- und Fluoreszenz-Spektroskopie durchgeführt. Alle drei Proteine weiden eine von Helices dominierte Sekundärstruktur auf. Die Untersuchung der thermischen Denaturierung zeigte einen Temperatur-abhängigen Übergang von α-helix zu Β-Struktur. In FOS-14 solubilisiertes Nicastrin zeigte übereinstimmend mit Daten aus der Elektronrnmikroskopie 31% helikale und 23% β-Faltblattstruktur. In Denaturierungsexperimenten erwies sich Nicastrin al sein relative stabiles Protein mit einer Schmelztemperatur von 59 °C für die Sekundärstruktur. Der Einfluss des Detergenz auf die Sekundärstruktur war schwach für PEN-2 und Presenilin, beeinflusste aber die Stabilität der beiden Proteine. PEN-2 durchlief eine 2-Schrittentfaltung mit einer intermediären Struktur zwischen 64-74 °C in FOS-14. In FOS-16 trat dagen eine typische Entfaltung mit zwei Zuständen und einer Schmelztemperatur von 65 °C auf. Presenilin-1 in FOS-14 wies eine Tm von 47 °C auf, in FOS-16 dagen 57 °C, und zeigte damit einen deutlichen Einfluss des Detergenz auf die Stabilität. Eine trunkierte Form von Presenilin-1 (DelE9) ohne die durch Exon 9 kodierte Region zwischen den Helices TM6 und TM7 zeigte eine Tm von 56 °C für beide Detergenzien. Offenbar verursacht das deletierte Strukturelement eine Beeinflussbarkeit der Stabilität des Proteins. Mit den gereinigten Proteinen wurden Kristallisationsexperimente durchgeführt und Bedingungen optimiert für die erhaltenen Kristalle von Nicastrin und PEN-2. Durch Western Blot konnte bestätigt werden, dass die Kristalle aus dem jeweiligen Protein bestanden. Die separat exprimierten und gereinigten Proteine Presenlin-1 und PEN-2 wurden in Liposomen rekonstituiert, um die in-vitro Assemblierung der γ-Sekretase zu untersuchen. Die erfolgreiche Insertion konnte durch ein Zentrifugationsexperiment und Resolubilisierung in CHAPSO bestätigt werden. In E. coli coexprimiertes Presenilin-1 und PEN-2 zeigte nach Solubilisierung keine proteolytische Aktivität, obwohl bei der Expression das Auftreten spezifische Fragmentierung von Presenilin-1 beobachtet wurde, welches die Bildung des autokatalytischen Sub-Komplexes der Sekretase bewies. Weiterhin wurde die physische Interaktion von Nicastrin und dem Substrat APPC-100 in Gegenwart von Detergenz durch eine pull-down Experiment gezeigt, welches die Bildung eines Substrat-bindenden Initiationskomplexes beweist. Die apparente Dissotiationskonstante wurde durch microscale thermophoresis zu 1-2 μM bestimmt. Diese Bindung unterstützt stark das Konzept von Nicastrin als initialen Substratrezeptor im γ-Sekretase Komplex.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.11.2016
Dateien geändert am:	29.11.2016
Promotionsantrag am:	23.09.2016
Datum der Promotion:	15.11.2016