Dokument: Entwicklung von Pseudomonas putida Ganzzellbiokatalysatoren zur Synthese oxyfunktionalisierter Verbindungen
| Titel: | Entwicklung von Pseudomonas putida Ganzzellbiokatalysatoren zur Synthese oxyfunktionalisierter Verbindungen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40373 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20161111-105029-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tieves, Florian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung
Eine wichtige Reaktion zur Funktionalisierung von Alkanen, Terpenen und anderen industriell relevanten Molekülen stellt die selektive Hydroxylierung inerter Kohlenwasserstoffbindungen dar. Die hohe Regio- und Stereoselektivität ihrer Hydroxylierung macht einige Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450) in diesem Zusammenhang zu besonders vielversprechende Katalysatoren. Zur Gewährleistung einer kontinuierlichen Bereitstellung der benötigen NAD(P)H-Kofaktoren können in P450-katalysierten Reaktionen Ganzzellsysteme eingesetzt werden. Ein dabei häufig auftretendes Problem ist die Toxizität der gebildeten Produkte oder des eingesetzten Substrats gegenüber den verwendeten rekombinanten Wirtszellen. Eine mögliche Lösung dieses Problems stellt die Verwendung von lösungsmitteltoleranten Stämmen, wie Pseudomonas putida, dar. In dieser Arbeit wurde der lösungsmitteltolerante Stamm P. putida DSM 12264 als Wirtsstamm ausgewählt und zur Herstellung oxyfunktionalisierter Moleküle eingesetzt. Hierfür wurde zunächst ein modular einsetzbarer Baukasten auf der Basis zweier kompatibler Expressionsplasmide entwickelt, der die Koexpression einer P450 mit geeigneten Redoxpartnerproteinen und weiteren rekombinanten Proteinen zur Optimierung der Ganzzellumsetzung in P. putida ermöglichte. Nach Konstruktion eines Knockoutstamms von P. putida DSM 12264 konnte eine hoch selektive Variante von P450 BM3 aus Bacillus megaterium (A264V/A328V/L437F) in dem erzeugten P. putida Ganzzellbiokatalysator erfolgreich zur selektiven Hydroxylierung von (R)-(+)-Limonen zu (R)-(+)-Perillaalkohol eingesetzt werden. Als Hauptursache für die geringe Produktivität im rekombinanten Ganzzellbiokatalysator konnte ein eingeschränkter Stofftransfer und eine geringe Enzymstabilität identifiziert werden. Eine verbesserte Produktion von (R)-(+)-Perillaalkohol konnte nach einigen Optimierungsschritten durch die Permeabilisierung der Zellen oder die Koexpression des äußeren Membranproteins AlkL aus P. putida erzielt werden. Unter optimierten Bedingungen konnten innerhalb von 3 h schließlich 530 µM (R)-(+)-Perillaalkohol produziert werden. Des Weiteren konnte der positive Effekt einer verbesserten Kofaktorverfügbarkeit auf die Produktivität von P. putida Ganzzellbiokatalysatoren in Verbindung mit der hoch aktiven P450cam und ihren natürlichen Redoxpartnerproteinen aus P. putida gezeigt werden. In der Hydroxylierung von Campher zu 5-exo-Hydroxycampher konnte durch die Koexpression einer Glyceroldehydrogenase (GldA) aus Escherichia coli oder einer Glucosedehydrogenase (GDH) aus B. megaterium die Produktbildung um das 6- bis 8-Fache gesteigert werden. Zusätzlich wurde CYP154A8 aus Nocardia farcinica in Ganzzellbiokatalysatoren zur Synthese von chiralen 2-Alkoholen ausgehend von linearen Alkanen untersucht. Sowohl E. coli als auch P. putida Ganzzellbiokatalysatoren waren in der Lage chirale 2-Alkohole herzustellen, dabei zeigte der lösungsmitteltolerante P. putida Stamm im eingesetzten Zweiphasensystem eine dem E. coli Stamm überlegene Aktivität und Stabilität. Ausgehend von Octan konnten durch den optimierten P. putida Ganzzellbiokatalysator 16 mM (S) 2-Octanol mit einem Enantiomerenüberschuss von 87% produziert werden. Dies entspricht mehr als dem 7-Fachen der bisher erzielten Konzentration im bereits beschriebenen System mit isolierten Enzymen. Durch die zusätzliche Koexpression einer Alkoholdehydrogenase (ADH) konnte der Enantiomerenüberschuss des Produkts bis auf 99% ee gesteigert werden. Ausgehend von Heptan, Octan und Nonan konnten durch Verwendung des optimierten P450 ADH-Systems 2,6 mM (S)-2-Heptanol mit 91% ee, 5,4 mM (S)-2-Octanol mit 97% ee bzw. 5,5 mM (S) 2-Nonanol mit 97% ee produziert werden. Die in dieser Arbeit erzielten Konzentrationen an chiralen 2-Alkoholen sind die höchsten, die durch ein P450-Ganzzellbiokatalysator bisher erzielten werden konnten. Neben der Produktion von chiralen 2-Alkoholen, konnte ein weiteres P450-ADH-System erfolgreich zur Herstellung von 2-Octanon und 2,7-Octandion ausgehend von Octan eingesetzt werden. *****************************************************************************Abstract Hydroxylation reactions represent a key step for the functionalization of alkanes, terpenes and other industrially relevant target molecules. In this context, cytochrome P450 monooxygenases (P450s) show promising properties as catalysts, as they are able to perform hydroxylation reactions of inert C-H bonds with high regio- and stereoselectivity. In order to ensure a continuous supply of the required NAD(P)H-cofactors, bacterial whole-cell systems can be used for P450-catalyzed reactions, which allow the direct conversion of a target molecule into desired products. One of the major limitations of recombinant bacterial cells in reactions like the P450-catalyzed oxidation of terpenes or alkanes is the toxicity caused by the substrate and/or the formed products. Therefore, the application of more robust host strains, such as Pseudomonas putida, is one solution to improve P450-based whole-cell biocatalysis for the production of oxyfunctionalized molecules. The first objective of this thesis was to develop a plasmid-based modular toolbox, which allows co-expression of P450s, suitable redox partners, and supportive enzymes, such as enzymes for cofactor regeneration and improved mass transfer, in P. putida. The second objective of this thesis was to develop and apply P. putida whole-cell biocatalysts for the synthesis of selectively functionalized molecules starting from selected inert alkanes and terpenes. For this purpose, the solvent tolerant P. putida DSM 12264 strain was chosen as host strain. After construction of a knockout strain of P. putida DSM 12264, a highly selective variant of P450 BM3 from Bacillus megaterium (A264V/A328V/L437F) was successfully used for the selective production of (R)-(+)-perillyl alcohol starting from (R)-(+)-limonene. Low substrate mass transfer and low enzyme stability were identified as main causes for restricted productivity. After several optimization steps, improved production of (R)-(+)-perillyl alcohol was achieved by cell permeabilization or co-expression of the outer membrane protein AlkL from P. putida, respectively. Under optimized conditions 530 µM (R)-(+)-perillyl alcohol was produced within 3 h. Moreover, a positive effect of enhanced cofactor availability was shown for the highly active P450cam from P. putida expressed along with its natural redox partners in P. putida whole-cell biocatalysts producing 5-exo-hydroxycamphor from camphor. Co-expression of glycerol dehydrogenase (GldA) from Escherichia coli or glucose dehydrogenase (GDH) from B. megaterium for enhanced cofactor regeneration resulted in a 6- to 8- fold increased product formation. Furthermore, CYP154A8 from Nocardia farcinica was integrated along with suitable redox partners into whole-cell systems for the production of chiral 2-alkanols starting from linear alkanes. Both recombinant E. coli and P. putida whole-cell biocatalysts tested were able to produce chiral 2-alkanols, but the solvent tolerant P. putida strain demonstrated advantages regarding activity and stability in the applied biphasic reaction system. The optimized P. putida whole-cell biocatalyst produced 16 mM (S) 2-octanol from octane with an enantiomeric excess of 87%, which is a 7-fold higher concentration than that achieved by a previously described system using isolated enzymes. The enantiopurity of the product could further be increased up to 99% ee by co-expression of an alcohol dehydrogenase (ADH) in the alkane oxidizing P. putida whole-cell biocatalyst. By using the optimized P450-ADH-system for the conversions of heptane, octane or nonane, 2.6 mM (S)-2-heptanol with 91% ee, 5.4 mM (S)-2-octanol with 97% ee, or 5.5 mM (S) 2-nonanol with 97% ee were produced, respectively. The achieved concentrations of chiral 2-alkanols are the highest reported for a P450-based whole-cell biocatalyst so far. Apart from the production of chiral 2-alkanols with P. putida whole-cell biocatalysts, a P450-ADH-cascade was also successfully used to produce 2-octanone and 2,7-octanedione starting from inert octane. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.11.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.11.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 31.08.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.10.2016 |
