Dokument: Charakterizierung von T-Zell-Antworten gegen Mykobakterien in Mukoviszidose Patienten und in an in vitro Infektionsmodell

Titel:Charakterizierung von T-Zell-Antworten gegen Mykobakterien in Mukoviszidose Patienten und in an in vitro Infektionsmodell
Weiterer Titel:Characterization of T cell responses against mycobacteria in Cystic Fibrosis patients and in an in vitro infection model
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40347
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20161109-101014-5
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Englisch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Nkwouano Ngongang, Vanesa [Autor]
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Dateien vom 07.11.2016 / geändert 07.11.2016
Beitragende:Prof.Dr. Jacobsen, Marc [Gutachter]
Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Diese Studie beschäftigt sich mit den Grundlagen der anti-Mykobakterien-Immunantwort beim Menschen. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit soll die Frage geklärt werden, warum Infektionen mit nicht-tuberkulösen Mykobakterien (NTM) durch das Immunsystem von immunkompetenten Menschen erfolgreich kontrolliert werden und nicht zu klinischen Symptomen führen, während Menschen mit bestimmten genetischen Prädispositionen – untersucht an Mukoviszidose (CF) Patienten – eine erhöhte Anfälligkeit für NTM wie Mycobacterium abscessus haben. Hierfür entwickelten wir einen neuartigen immunologischen Test, um M. abscessus-spezifische Immunantworten in CF-Patienten nachzuweisen. Unser Test umgeht sowohl das Sammeln von Sputum-Proben – in der Regel nicht verfügbar bei pädiatrischen Patienten – und die Kultur der Mykobakterien – welche in der Regel von anderen Mikroorganismen überwuchert sind. Blutproben von CF-Patienten wurden an der Universitäts-Kinderklinik Düsseldorf gesammelt, mit Proteinderivate (PPD) verschiedener Mykobakterien restimuliert und Mykobakterien-spezifische T-Zell-Antworten wurden analysiert. T-Zell-Immunität induziert durch M. abscessus-spezifische PPD detektierte akute M. abscessus-Infektionen in einer Untergruppe von Patienten mit positiver M. abscessus-Kultur (durch Routinediagnostik nachgewiesen). Vergleiche verschiedener mykobakterieller Antigenen deutete auf die Anwesenheit von M. abscessus-spezifische Epitope. Phänotypische Analyse von T-Zellen, welche auf M. abscessus-spezifische PPD reagieren, zeigte eine erhöhte Produktion von CD40L-positive T-Zellen, welche das Interleukin (IL)-2 fehlen, in CF-Patienten mit akuter M. abscessus-Kolonisierung. Eine funktionelle Bedeutung dieser Zellen ist jedoch noch unklar.
Angewendet in klinische Studien, würden funktionelle Assays dazu beitragen, die Bedeutung von Biomarker-Kandidaten während Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit haben wir einen neuartigen Durchflusszytometrie-basierten funktionellen in vitro Assay etabliert, um anti-mykobakterielle Immunantworten, sowie Interaktionen zwischen infizierte Makrophagen und Wirts-T-Zellen zu charakterisieren. Im Gegensatz zu verfügbaren Assays ermöglicht unseren neuen Assay die gleichzeitige Analyse von mykobakteriellen Wachstumshemmung durch Effektor-T-Zellen und zytotoxische Effekte auf Makrophagen. Der Assay beruhte auf Infektion von in vitro generierten Makrophagen (MDM) mit einem M. bovis BCG Reporterstamm (LD-BCG). Co-Kultur von infizierten MDM mit polyklonal-aktivierten oder Mykobakterien-spezifische Effektor-T-Zellen zeigte eine konzentrations- und Stimulus-abhängige signifikante Reduzierung der Lebensfähigkeit von LD-BCG und MDM. Stimulation von CD4+ oder CD8+ T-Zellen mit polyklonalen Aktivatoren oder Mykobakterien-spezifische Antigene erhöhte die zytotoxische Wirkung dieser Zellen, die sich nur in ihrer Fähigkeit unterscheiden, MDM-Apoptose zu induzieren. Insbesondere induzierten PPD-spezifische CD4+ T-zellen höhere Proportionen an infizierte MDM in der frühen oder späten Apoptose.
Zusammengefasst, unser immunologischer Detektionstest Test würde die Diagnose von mykobakteriellen Infektionen bei Mukoviszidose-Patienten verbessern, speziell bei Kleinkindern, die kein Sputum auswerfen können. Mit diesem Test wiesen wir auf das Potenzial von CD40L+ und IL-2- T-Zellen als Kandidatenmarker für die Identifizierung von CF-Patienten mit einer akuten M. abscessus Infektion hin. Die funktionelle Bedeutung dieser Zellen während – sowie von anderen Biomarker-Kandidaten für – mykobakterielle(n) Infektionen könnte mit Hilfe unser neuen funktioneller in vitro Assay untersucht werden.

This study focuses on the basics of anti-mycobacterial immune response in humans. In the first part of this PhD thesis, we aimed to clarify why infections with non-tuberculous mycobacteria (NTM) are successfully controlled by the immune system of immune competent people and do not lead to clinical symptoms, while people with certain genetic predispositions – studied in Cystic Fibrosis (CF) patients – have an increased susceptibility to NTM like Mycobacterium abscessus. For this, we developed a novel immunological test to detect M. abscessus-specific immune responses in CF patients. Our test circumvents both the collection of sputum samples – usually not available in paediatric patients – and the cultivation of the mycobacteria – which are frequently overgrown by other microorganisms. Blood samples of CF patients were collected at the University Children´s Hospital Düsseldorf, restimulated with purified protein derivatives (PPD) of different mycobacteria and mycobacteria-specific T cell responses were analysed. T cell immunity induced by M. abscessus-specific PPD detected acute M. abscessus infection in a subset of CF patients with positive M. abscessus culture (as accessed by routine diagnostics). Comparisons of different mycobacterial antigens suggested the presence of M. abscessus-specific epitopes. Phenotypic analysis of T cells reacting to M. abscessus-specific PPD revealed an increased production of CD40 positive T cells lacking interleukin-(IL)-2 in CF patients with acute M. abscessus colonization, although a functional relevance of these cells is still unclear.
Functional assays might help to evaluate candidate biomarkers in the context of host-pathogen interactions, when applied during clinical studies. In the second part of this PhD thesis, we established a novel polychromatic flow-cytometry-based functional in vitro assay to characterize anti-mycobacterial immune responses and interactions between infected macrophages and host T cells. In contrast to available assays, our novel assay enabled concomitant evaluation of mycobacterial growth inhibition by effector T cells and cytotoxic side effects on host macrophages. Our functional in vitro assay was based on infection of monocyte-derived macrophages (MDM) with a M. bovis BCG reporter strain (LD-BCG). Co-culture of infected MDM with polyclonal-activated or mycobacteria-specific effector T cells markedly reduced the viability of both LD-BCG and MDM in a concentration- and stimulus-dependent manner. Stimulation of CD4+ or CD8+ T cells with polyclonal activators or mycobacteria-specific antigens increased the cytotoxic effect of these cells, which only differ in their capacity to induce MDM apoptosis. In particular, PPD-specific CD4+ T cells induced significantly higher levels of infected MDM in early or late apoptotic stage than did PPD-specific CD8+ T cells.
Taken together, our novel immunological test might improve the diagnosis of mycobacterial infections in CF patients, in particular in young children unable to expectorate sputum. Using this test, we pointed out the potential of CD40L+ and IL-2- T cells as candidate markers to identify CF patients with an acute M. abscessus infection. The functional relevance of these cells during – as well as of other biomarker candidates for – mycobacterial infections might be evaluated using the newly established functional in vitro assay.
Lizenz:In Copyright
Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:09.11.2016
Dateien geändert am:09.11.2016
Promotionsantrag am:20.07.2016
Datum der Promotion:08.09.2016
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