Dokument: Molecular characterization and phenotyping of circulating tumor cells for therapy optimization in metastatic breast cancer

Titel:	Molecular characterization and phenotyping of circulating tumor cells for therapy optimization in metastatic breast cancer
Weiterer Titel:	Molekulare Charakterisierung und Phänotypisierung zirkulierender Tumorzellen zur Therapieoptimierung beim metastasierten Mammakarzinom
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40280
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161107-114458-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schneck, Helen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 33,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.10.2016 / geändert 30.10.2016
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Neubauer, Hans [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Czekelius, Constantin [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Breast cancer is a systemic disease with primary tumors shedding tumor cells already at an early stage into the blood circulation. The circulating tumor cells (CTCs) represent the putative precursors of subsequent metastatic disease. A key to better understand systemic cancer progression and to improve the effectiveness of systemic therapy might lie in a holistic and comprehensive clarification of CTC biology. Thus, it is important to characterize CTCs at various molecular levels (DNA/RNA/protein), whereby at first their specific and efficient enrichment is needed. With regard to CTC enumeration, the EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule)-based CellSearch® system has facilitated CTC research enormously. During dissemination, however, CTCs might downregulate or completely lose their EpCAM expression triggered by a process called epithelial-mesenchymal-transition (EMT). Consequently, the question remains whether such non-epithelial-like CTCs are missed by an EpCAM-dependent CTC enrichment approach. Especially these cells are supposed to be more resistant against therapeutic agents and might represent the metastasis-relevant CTC population. In order to get access to this EpCAMlow/neg CTC subset, a novel EpCAM-independent enrichment strategy analyzing blood from metastatic breast cancer patients was established. By immunomagnetic bead-based multi-marker targeting of proteins presented by tumor cells on their surface (e.g. Trop2, CD49f, c-Met, CK8, CD44, ADAM8, CD146) 29 blood samples depleted for EpCAMpos cells from 25 patients were examined. 95 potential EpCAMneg CTCs in 69% of the samples were identified. Further, EpCAMneg cytokeratin (CK)/CD45-double positive cells could be traced in 28 out of 29 samples. Genomic analysis confirmed the malignant origin of EpCAMneg cells captured with CD44 antibodies. In the future, further comparative analysis of EpCAMneg CTCs and their EpCAMpos counterparts will provide new insights into tumor cell heterogeneity. Additionally, mutational analysis of CTCs might contribute to unravel intratumoral heterogeneity and to select for resistant tumor cells under biological therapies. To this end, simultaneous analysis for several activating single nucleotide polymorphisms within the PIK3CA (Phosphatidylinositol-3-kinase, catalytic subunit alpha) gene in EpCAMpos CTCs was conducted: 57 blood samples from 44 patients were investigated by a workflow comprising the SNaPshot technology. Thereby, 12 mutations in exon 9 (E545K, 50%) and exon 20 (H1047R, 50%) in 15.8% of the patient samples were identified. The detection of mutations in single cells was successful as well. Mutational analysis in CTCs can be used to study resistance to targeted therapies such as against HER2 or against other breast cancer relevant targets. Taken together, the herein presented methods – suitable for investigating distinct EpCAMpos and EpCAMneg CTC subsets on the molecular level - represent valuable and promising tools for improved breast cancer diagnostics, monitoring of treatment efficacy and will pave the way for new findings in anti-cancer research. Brustkrebs ist eine systemische Erkrankung, bei der sich bereits in einem frühen Stadium Tumorzellen vom Primärtumor absiedeln und in den Blutkreislauf gelangen. Diese zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) gelten als vermeintliche Vorläufer für eine nachfolgende Metastasierung. Der Schlüssel zu einem besseren Verständnis einer systemischen Tumorprogression sowie zur Optimierung der Therapiewirksamkeit könnte in einer ganzheitlichen und umfassenden Aufklärung der CTC-Biologie liegen. Daher ist es wichtig, CTCs auf verschiedenen molekularen Ebenen (DNA/RNA/Protein) zu charakterisieren, wobei zunächst eine spezifische und effiziente Anreicherung erforderlich ist. Im Hinblick auf die CTC-Anreicherung hat das EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) basierte CellSearch®-System die CTC-Forschung enorm vorangetrieben. Während der Tumorzelldisseminierung können CTCs jedoch aufgrund der sogenannten Epithelial-mesenchymalen-Transition (EMT) die Expression von EpCAM herunterregulieren oder gar völlig verlieren. Daher bleiben CTCs mit geringer oder fehlender EpCAM Expression von EpCAM abhängigen Anreicherungssystemen möglicherweise unentdeckt. Gerade diese Zellen könnten jedoch gegenüber Therapeutika widerstandsfähiger und für die Metastasierung relevant sein. Um sich auch jene EpCAM-schwache/-negative Untergruppe der CTCs zugänglich zu machen, wurde eine neuartige, EpCAM unabhängige Anreicherungsstrategie entwickelt, mit der die Analyse von Blutproben aus Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs möglich ist. Mit Hilfe einer immunmagnetischen Bead-Anreicherung und Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenmarker, z. B. gegen Trop2, CD49f, c-Met, CK8, CD44, ADAM8, CD146, wurden 29 Blutproben, bei denen die EpCAM-positiven Zellen zuvor entfernt wurden, von 25 Patientinnen untersucht. Dabei konnten 95 potenzielle CTCs in 69% der Proben identifiziert werden. In 28 der 29 Proben wurden darüber hinaus EpCAM-negative, Cytokeratin (CK)-/CD45 doppelt positive Zellen detektiert. Eine Genomanalyse lieferte den Nachweis über den malignen Ursprung von EpCAM-negativen Zellen, die mit CD44-spezifischen Antikörpern isoliert worden waren. In Zukunft wird man durch weitere vergleichende genomische Analysen der EpCAM-positiven und EpCAM-negativen CTCs neue Erkenntnisse über die Tumorzell-Heterogenität gewinnen können. Auch der Nachweis von Mutationen in CTCs kann dazu beitragen, die zelluläre Heterogenität innerhalb eines Tumors zu enträtseln und solche CTCs aufzuspüren, die sich resistent gegenüber biologischen Therapieverfahren zeigen. Zu diesem Zweck wurden mehrere aktivierende Einzelnukleotid-Polymorphismen im PIK3CA (Phosphoinositid-3-Kinasen, alpha Untereinheit)-Gen simultan für EpCAM-positive CTCs analysiert. Dies konnte mit einem Arbeitsablauf, der die SNaPshot-Technologie beinhaltet, realisiert werden: 57 Blutproben von 44 Patientinnen wurden untersucht, wobei 12 Mutationen in Exon 9 (E545K, 50%) und Exon 20 (H1047R, 50%) in 15,8% aller Proben identifiziert werden konnten. Der Mutationsnachweis in Einzelzellen war ebenfalls erfolgreich. Diese Mutationsanalysen in CTCs erlauben es künftig, Resistenzen gegenüber zielgerichteten Therapien, wie z. B. gegen HER2 oder andere für Brustkrebs relevante Targets, zu erforschen. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die hier dargestellten Methoden, die für die molekulare Untersuchung beider CTC-Untergruppen (EpCAM-positiv/-negativ) geeignet sind, wertvolle und vielversprechende Ansätze hinsichtlich der Brustkrebsdiagnostik sowie der Überwachung der Therapiewirksamkeit repräsentieren und neue Wege in der Krebsforschung ebnen werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	07.11.2016
Dateien geändert am:	07.11.2016
Promotionsantrag am:	25.01.2016
Datum der Promotion:	17.08.2016