Dokument: Charakterisierung von Aminosäure-Ammoniaklyasen & Aminomutasen zur Produktion chiraler α- und β- Aminosäuren
| Titel: | Charakterisierung von Aminosäure-Ammoniaklyasen & Aminomutasen zur Produktion chiraler α- und β- Aminosäuren | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of amino acid ammonia lyases & aminomutases for the production of chiral α- und β-amino acids | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=39881 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20161103-105533-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Dreßen, Alana [Autor] | |||||||
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| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Enantiomerenreine unnatürliche Aminosäuren sind wichtige Bausteine für die Herstellung von Chemikalien und Pharmazeutika oder sind selber pharmakologisch aktiv. Beispiel sind 2-chloro-Phenylalanin, eine Vorstufe für die Produktion von Blutdrucksenkern und L-Dopa, das zur Behandlung der Parkinson-Krankheit eingesetzt wird oder (R)-β-Phenylalanin, welches Bestandteil der Seitenkette des Antitumor-Medikaments Taxol ist. Um Zugang zu dieser Substanzklasse in unsere Arbeitsgruppe zu erhalten, wurde eine Toolbox mit Ammoniaklyasen (AL) und Aminomutasen (AM) erstellt werden, die den Kofaktor MIO enthalten. Diese Toolbox besteht aus vier Wildtyp Phenylalanin und Tyrosine Ammoniaklyasen (PAL/TAL), einer Variante mit geänderter Substratspezifität und drei Wildtyp Phenylalanin und Tyrosine Aminomutasen aus Pflanzen, Hefe und Bakterien.
Alle Ammoniaklyasen wurden vergleichend bezüglich der kinetischen Parameter, pH- und Temperaturoptima für die Deaminierung der natürlichen Substrate charakterisiert. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der stereoselektiven Aminierung von Zimtsäure (CA)-Derivaten zur Herstellung von enantiomeren reinen α- und β-Aminosäuren, daher war die Untersuchung des Substratspektrums und der Reaktionsparameter das Hauptziel. Von den getesteten Ammoniaklyasen zeigte die PAL aus Arabidopsis thaliana, welche bisher noch nicht näher charakterisiert wurde, die besten Umsätze verglichen mit den Enzymen aus Petroselinum crispum und Rhodosporidium toruloides, welche gut charakterisiert sind und industriell eingesetzt werden. AtPAL2 zeigt schnellere Umsätze mit 3-F-CA (91.2 %), 4-F-CA (84.7 %) and 2-Cl-CA (96.4 %) in Batch Reaktionen verglichen mit den Referenzenzymen. Da 2-Cl-L-Phe ein wichtiges Intermediat für die Synthese von ACE Inhibitoren (Blutdrucksenkern) ist, wurde diese Reaktion im größeren Maßstab in verschiedenen Reaktoren und mit verschiedenen Betriebsweisen untersucht. Mit einem kontinuierlich betriebenen Enzym-Membranreaktor (EMR) konnten die Raum-Zeit-Ausbeute und die Katalysator-Produktivät von 11,8 g/L*d und 10,8 g Produkt pro g Katalysator im Batch, auf 67.8 g/L*d und 46.8 g/g im EMR erhöht werden. Das Produkt 2-Cl-L-Phe konnte durch einfache Volumenreduktion und Kristallisation mit einer Ausbeute von 57 % und hoher Reinheit isoliert werden. Um die Wiederverwendbarkeit der AtPAL2 zu erhöhen, wurde eine Immobilisierung an Cellulose über Cellulose-Binde-Module (CBMs) aus C. fimi untersucht. Das auf Avicel immobilisierte Fusionsprotein der AtPAL2 mit einer C-terminalen CBM zeigte nach elf einstündigen 2-Cl-CA Aminierungsreaktionen im Batchreaktor eine Restaktivität von 81,5 %. Außerdem konnte das Fusionsprotein in einem mit Avicel befüllten Strömungsrohr-Reaktor direkt aus dem Rohextrakt immobilisiert werden, indem der E. coli Rohzellextrakt mit dem Enzym durch den Reaktor gepumpt wurde. Nach der Immobilisierung wurde der Reaktor für die Aminierung von 2-Cl-CA verwendet. Die erreichte Raum-Zeit-Ausbeute lag bei 248,6 g/L*d und die Produktivität bei 18,5 g/g. Das Substratspektrum der TAM aus Chondromyces crocatus (CcTAM), das ebenfalls bis jetzt nicht im Detail beschrieben wurde, wurde untersucht und mit den PAMs aus Taxus canadensis (TcaPAM) und dem gut charakterisiertem Enzym aus Taxus chinensis (TchPAM) verglichen. TcaPAM ist als Ganzzellkatalysator weniger aktiv als TchPAM, aufgrund eines geringeren Expressionsniveaus und führt zu mehr Nebenprodukten. Beide PAMs führen zur Bildung einer Mischung von α- und β-Aminosäuren, die nur schwer zu trennen ist. CcTAM hat ein weniger breites Substratspektrum im Vergleich zu den PAMs, allerdings wurden akzeptierte Substrate in ersten Messungen nur zur gewünschten (R)-β-Aminosäure umgesetzt. Daher wurde die CcTAM ebenfalls mit einer CBM fusioniert, um die Handhabbarkeit im Prozess zu verbessern. Das Fusionsprotein CcTAM-CBM wurde nur zu einem sehr geringen Teil löslich exprimiert, daher wurden mit diesem Fusisonsprotein keine weiteren Versuche durchgeführt.Enantiopure non-natural amino acids are valuable building blocks for the production of chemicals and pharmaceuticals or are themselves pharmacologically active. Examples are 2-chloro-phenylalanine, a precursor for the production of a hypertension pharmaceutical and L-Dopa, which is used for the treatment of Parkinson desease or (R)-β-phenylalanine, which is part of the side chain of the antitumor drug Taxol. To get access to this class of compounds, a toolbox of MIO-dependent ammonia lyases and aminomutases was generated including four wild-type phenylalanine and tyrosine ammonia lyases (PAL/TAL), one variant with altered substrate specificity, and three wild-type phenylalanine and tyrosine aminomutases (PAM/TAM) from plants, yeast, and bacteria. All ammonia lyases were comparatively characterized with respect to kinetic parameters, pH- and T-optima for the deamination reaction of their natural substrates. Scince the focus of this thesis was on the stereoselective amination of cinnamic acid (CA) derivatives to yield enantiopure α- and β-amino acids, the investigation of the substrate ranges and reaction parameters was the main goal. Among the tested ammonia lyases in the toolbox PAL from Arabidopsis thaliana (AtPAL2), an enzyme which was not characterized in detail yet, performed best, compared to the enzymes from Petroselinum cripsum and Rhodosporidium toruloides, which are well studied and industrially applied. AtPAL2 shows significant faster conversion of 3-F-CA (91.2 %), 4-F-CA (84.7 %) and 2-Cl-CA (96.4 %) in batch reactions. Due to the importance of 2-Cl-L-Phe as key intermediate for the production of hypertension drugs, this reaction was further investigated in larger scale using different reactor types and reaction modes. With a continuous enzyme membrane reactor the space-time-yield (STY) and productivity per catalyst (cell dry weight: CDW) could be enhanced from 11.8 g/L*d and 10.8 g/gDCW in batch to 67.8 g/L*d and 46.8 g/gDCW. The product 2-Cl-L-Phe could be isolated by simple volume reduction and crystallization with a yield of 57 % and high purity. To improve the reusability of the AtPAL2 an immobilization strategy using cellulose binding modules (CBMs) from C. fimi was investigated. AtPAL2 fused with a C-terminal CBM immobilized on Avicel showed 81.5 % remaining activity in the amination of 2-Cl-CA after eleven 1 h batch reaction cycles. Furthermore AtPAL2-CBM was immobilized on Avicel in a plug-flow reactor by simply pumping the E. coli crude cell extract containing the enzyme through a column filled with Avicel, which was afterwards directly used for biotransformation by pumping the substrate through the column. The STY reached 248.6 g/L*d and the productivity was 18.5 g/gDCW. The substrate range of the TAM from Chondromyces crocatus (CcTAM), which was not described in detail until now, was investigated and compared to the PAMs from Taxus canadensis (TcaPAM) and the well-studied enzyme from Taxus chinensis (TchPAM). Whole cells containing TcaPAM are less active compared to whole cells containing TchPAM, due to a lower expression level and produced more side-products. Both PAMs lead to the formation of a mixture of α- and β-amino acids, which is difficult to separate. CcTAM has a less broad substrate range compared to PAMs, but produced only the desired (R)-β-amino acids in initial measurements. Therefore CcTAM was investigated for immobilization studies to improve the handling of the enzyme by fusing the enzyme to the C-terminal CBM from C. fimi, but due to a strongly decreased soluble expression the fusion protein CcTAM-CBM was not used for futher experiments. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.11.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.11.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.05.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.07.2016 |
