Dokument: Isolierung, Identifizierung und biochemische Charakterisierung Dialkylphthalat spaltender Esterasen
| Titel: | Isolierung, Identifizierung und biochemische Charakterisierung Dialkylphthalat spaltender Esterasen | |||||||
| Weiterer Titel: | Isolation, identification and biochemical characterization of dialkylphthalate hydrolyzing esterases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3918 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20070313-094830-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Pütz, André [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | biochemische Charakterisierung, Dialkylphthalate, Esterasen, PET, Enzymkinetik, Modellsubstrat | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Isolierung und Identifizierung von Esterasen, die eine enzymatische Aktivität gegenüber Polyethylenterephthalat (PET) aufweisen. Ein auf dem Modellsubstrat Diethylphthalsäure (DEP) durchgeführtes mikrobiologisches screening führte zur Isolierung der Stämme B. licheniformis 19C5 und B. subtilis 17A1. Aus Letzterem wurde die Dialkylphthalat-Hydrolase biochemisch gereinigt, mittels MALDI-TOF analysiert und als para-Nitrobenzyl-Esterase (pNB-Est) identifiziert. Die korrespondierenden Gene der Esterasen aus den Isolaten B. subtilis 17A1 (pNB-Est17) und B. licheniformis 19C5 (pNB-Est19) wurden durch die Erstellung von Genombanken und die Sequenzierung der genomischen Fragmente esterolytisch aktiver Klone erhalten. Durch database-mining wurde eine weitere para-Nitrobenzyl-Esterase aus B. licheniformis DSM13 (pNB-Est13) identifiziert. Die para-Nitrobenzyl-Esterasen codierenden Gene wurden in Expressions-vektoren subkloniert, heterolog in E. coli als Intein- bzw. Poly-Histidin-Fusionsproteine exprimiert und mittels Affinitätschromatographie zur biochemischen Homogenität gereinigt.
Bei der enzymologischen Charakterisierung stand die Ermittlung der kinetischen Parameter wie vmax, kM, kcat und kcat/kM gegenüber verschiedenen kurzkettigen Dialkylphthalaten im Vordergrund. Das bei der enzymatischen Hydrolyse durch Esterasen entstehende Produkt konnte mittels GC/MS-Analysen als der jeweilige korrespondierende Monoester der Ausgangsverbindung identifiziert werden. Die Kettenlängenspezifitäten der Esterasen wurden durch Messungen mit para-Nitrophenylestern unterschiedlicher Kettenlängen ermittelt. Für die para-Nitrobenzyl-Esterase pNB-Est13 wurde sowohl das Temperatur- und pH-Optimum als auch die Temperatur- und pH-Stabilität ermittelt. Das Substratspektrum der pNB-Est13 wurde durch enzymatische Aktivitätstests gegenüber Triglyceriden und Methylestern erweitert und der Einfluss von Detergenzien, Metallsalzen, PMSF und 4-FPBA auf die Aktivität bestimmt. Bei der Hydrolyse von PET-Nanopartikeln konnte Terephthalsäure-Diethylenglykolester als Produkt mittels LC/MS nachgewiesen werden. Die N-terminale Fusion von pNB-Est19 und der Signalsequenz von LipA aus B. subtilis 168 führte zur Sekretion der Esterase durch B. subtilis TEB1030 ins Medium. Mit Bis-(p-methyl-benzoesäure)-ethylenglykolester (PET-Dimer) konnte ein Substrat synthetisiert werden, welches die Grundlage eines high-throughput-screening-Systems zur schnellen Identifizierung potentieller PET-Esterasen bildete. Gerichtete Evolution (epPCR) führte zur Isolierung von zwei Enzym-Mutanten mit mutmaßlich erhöhter Aktivität, so dass die Funktionalität dieses Systems nachgewiesen werden konnte.The aim of this work was to isolate and identify esterases that have the ability to hydrolyse poly(ethylene terephthalate) (PET). Two microorganisms B. licheniformis 19C5 and B. subtilis 17A1 were isolated using a screening based on model substrate diethyl phthalate (DEP). The dialkyphthalate hydrolase from the wild type organism B. subtilis 17A1 was biochemically purified, analyzed with MALDI-TOF, and identified as a para-nitrobenzyl esterase (pNB-Est). Two esterase genes (pNB-Est19; pNB-Est17) were identified from the two isolates B. licheniformis 19C5 and B. subtilis 17A1 after sequencing the inserts of active clones from genomic libraries. Using database-mining another B. licheniformis DSM13 para-nitrobenzyl esterase (pNB-Est13) was identified. The para-nitrobenzyl esterase genes were subcloned into expression vectors, heterologously expressed in E. coli as intein and poly histidine fusion proteins and purified to biochemical homogeneity using affinity chromatography. The biochemical characterization of these enzymes resulted in the determination of the kinetic parameters vmax, kM, kcat, kcat/kM using short chain dialkylphthalates. The product of the incubation of the three esterases with dialkylphthalates was identified as the corresponding monoester using GC/MS analysis. The chain length specificity was determined using para-nitrophenyl esters with different chain lengths. The pH and temperature profile of pNB-Est13 and the temperature and the pH stability was determined. The selectivity of pNB-Est13 towards substrates was demonstrated using triglycerides and methyl esters with different chain lengths. The effect of metal ions, surfactants, PMSF and 4-FPBA were also determined. After incubation with pNB-Est13 the hydrolysis product of PET nano particles was identified as diehtylene glycol terephthalate using LC/MS. Using the N-terminal fusion of pNB-Est19 with the signal sequence from lipase A (B. subtilis 168) and homologous expression of B. subtilis TEB1030, the esterase could be secreted to the growth media. A new high throughput agar plate assay was developed based on the model substrate bis-(p-methylbenzoic acid)-ethylene glycol ester (PET dimer) that was synthesized in this work. Using this screening potential PET-esterases could be obtained easily. The functionality of this agar plate assay was demonstrated by isolating two potentially improved epPCR mutants demonstrating larger halos in this test system. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.03.2007 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.03.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.11.2006 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.01.2007 |
