Dokument: Analyse der neuen potentiellen Effektorproteine CPn0712, CPn0677 und CPn0678 von Chlamydia pneumoniae

Titel:	Analyse der neuen potentiellen Effektorproteine CPn0712, CPn0677 und CPn0678 von Chlamydia pneumoniae
Weiterer Titel:	Analysis of the new potential effector proteins CPn0712, CPn0677 and CPn0678 of Chlamydia pneumoniae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38920
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160914-092544-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.Biol. Hänsch, Sebastian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.07.2016 / geändert 11.07.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Chlamydia pneumoniae, CPn0712, CPn0677, CPn0678, effector protein
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Chlamydia pneumoniae ist ein weit verbreitetes Gram-negatives Bakterium mit einem biphasischen, obligat intrazellulären Lebenszyklus. Es infiziert die oberen Atemwege des Menschen und kann bei einem schweren Verlauf zu Lungenentzündungen führen. Beginnend mit der initialen Internalisierung der infektiösen Elementarkörperchen (EB), über die intrazelluläre Replikation der differenzierten Retikularkörperchen (RB) bis zur Freisetzung, findet eine konstante Manipulation der humanen Wirtszelle statt, welche unter anderem über so genannte Effektorproteine bewirkt wird. Diese Proteine werden über das Typ-III Sekretionssystem (T3SS) in die Wirtszelle transferiert und beeinflussen dort direkt oder indirekt Wirtszellprozesse. Bisher sind nur wenige Effektorproteine von C. pneumoniae bekannt, obwohl ein ausführliches Wissen über diese Proteinklasse unerlässlich für das Verständnis der Infektion dieses Humanpathogens ist. Das Protein CPn0712 wurde bereits zuvor als Strukturkomponente des T3SS von Chlamydien beschrieben. Interessanterweise besitzt CPn0712 eine Chlamydien-spezifische N-terminale Verlängerung, der bisher keine Funktion zugeordnet werden konnte. Für diesen Bereich von CPn0712 wurde eine mögliche Funktion als Effektorprotein postuliert. CPn0677 und CPn0678 sind hypothetische Proteine, die anhand vorläufiger Daten als Adhäsionsproteine eingeordnet wurden, obgleich sie in Shigella heterolog funktionierende N-terminale T3SS- Signalpeptide tragen. Darüber hinaus wurde die Interaktion beider Proteine mit dem humanen Protein Sorting nexin 9 (SNX9) beschrieben, welches eine wichtige Funktion während der humanen Endozytose einnimmt. CPn0677 und CPn0678 weisen Parallelen zu einem sekretierten Effektorprotein aus dem enteropathogenen Escherichia coli auf, was die mögliche Funktion von CPn0677 und CPn0678 als Effektorproteine nahe legte. Daher war das Ziel dieser Arbeit die detaillierte Analyse der chlamydialen Proteine CPn0712, CPn0677 und CPn0678 unter dem Aspekt einer potentiellen Effektorprotein-Funktion. CPn0712 wird während der mittleren bis späten Infektion exprimiert und lokalisiert subzellulär bakterienassoziiert, sowie zum Teil Inklusionsmembran-assoziiert. Spezifische Zugänglichkeitsanalysen identifizierten CPn0712 allerdings eindeutig als intrainklusional und später als intrachlamydial. Hochauflösende Mikroskopie bestätigte die Lokalisierung von CPn0712 dicht an der Inklusionsmembran, jedoch intrainklusional. Weiterhin konnte der zuvor beobachtete CPn0712-induzierte wachstumsdefekte Phänotyp bei Expression in Saccharomyces cerevisiae auf eine C-terminale Transmembrandomäne zurückgeführt werden, was ebenfalls gegen eine spezifische Funktion als Effektorprotein spricht. Eine Effektorfunktion von CPn0712 konnte daher ausgeschlossen werden. Weitere potentielle Funktionen des N-Terminus von CPn0712, neben der einer Strukturkomponente des T3SS, sind somit wahrscheinlich nur intrachlamydial möglich. Die subzelluläre Lokalisation von CPn0677 und CPn0678 konnte zu späten Zeitpunkten als EB-assoziiert beschrieben werden. Zugänglichkeitsanalysen dieser Proteine zu den gleichen Zeitpunkten zeigten allerdings deutlich eine intrachlamydiale Lokalisation beider Proteine. Mit dem Fokus auf CPn0678 konnte darüber hinaus in mikroskopischen Experimenten die Sekretion dieses Proteins zu frühen Zeitpunkten nachgewiesen werden. In weiteren Analysen konnte die Fähigkeit von CPn0678 zur Tetramerisierung und zur Membranassoziation in Transfektions-Experimenten identifiziert werden. Die Membranassoziation konnte mittels Deletionsvarianten auf eine amphipathische Helix (APH) im N-terminalen Bereich des Proteins eingegrenzt werden, die höchst wahrscheinlich über benachbarte Aminosäuren (AS) Spezifität zur Plasmamembran (PM) vermittelt. Ähnliche Helices konnten dann aufgrund einiger bioinformatischer Analysen in einer Vielzahl von Effektoren anderer Gram-negativer Bakterien identifiziert werden. Weiterhin wurde erstmalig die Interaktion von intrazellulärem humanen SNX9 mit chlamydialem CPn0678 in der endogenen in vivo Situation zu frühen Zeitpunkten der Infektion nachgewiesen. Diese Interaktion ist essentiell abhängig von einer C-terminalen prolinreichen Region (PRR) in CPn0678, welche ein RxxPxxP-Motiv aufweist, das als spezifisches Bindungsmotiv von SNX9 bekannt ist. Die Rekrutierung von SNX9 zu adhärierten Chlamydien konnte in der frühen Infektion bzw. zu ektopisch exprimiertem CPn0678 in der Transfektion beobachtet werden. Homologien zwischen CPn0677 und CPn0678 lassen für CPn0677 ebenfalls Sekretion, Membranassoziation und SNX9-Bindung vermuten. Regionen mit unbekannter Funktion oder Homologie in CPn0677 legen mögliche weitere Funktionen nahe. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass CPn0678 für die Infektion wichtig ist, denn transfiziertes CPn0678 löste einen dominant-negativen Effekt auf die Infektion aus. Außerdem nahm transfiziertes CPn0678 direkten Einfluss auf die humane Endozytose. Die Daten lassen eine Modulation der humanen Endozytose durch den Effektor CPn0678 in der C. pneumoniae Infektion vermuten, wodurch es ein Schlüsselprotein der frühen Infektion sein könnte. Zusammenfassend wurden die Effektorfunktion von CPn0712 und die Adhäsinfunktionen von CPn0677 und CPn0678 weitestgehend ausgeschlossen. CPn0678 konnte erstmalig als sekretiertes Effektorprotein identifiziert werden, welches vermutlich mit humanem SNX9 und der humanen PM interagiert und so eine wichtige Rolle in der frühen Infektion von C. pneumoniae einnimmt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	14.09.2016
Dateien geändert am:	14.09.2016
Promotionsantrag am:	15.04.2016
Datum der Promotion:	09.06.2016