Dokument: Exploiting alcohol dehydrogenases in the asymmetric synthesis of hydroxy compounds: An easy, highly efficient and sustainable access to chiral building blocks

Titel:	Exploiting alcohol dehydrogenases in the asymmetric synthesis of hydroxy compounds: An easy, highly efficient and sustainable access to chiral building blocks
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38870
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160705-083311-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müller, Marion [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,12 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.07.2016 / geändert 04.07.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Asymmetric synthesis generates chiral compounds from prochiral ones. The former are important building blocks for the synthesis of pharmaceuticals, fine chemicals and agrochemicals. One example of a much sought-after chiral key building block is (2S,5S)-hexanediol. The compound is obtained through a two-stage reduction from 2,5-hexanedione. Chemical synthesis is both economically and environmentally unfriendly, mainly due to low atom economy, production of unwanted by-products, harsh reaction conditions and the need for a transition metal catalyst, which is both expensive and toxic. There is currently only one commercially viable biocatalytic route: biotransformation of the γ-diketone mediated by baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae). However, because of the small quantities of the responsible enzyme in the cell, cell productivity is low, resulting in a low reaction velocity. The aim of the work presented in this doctoral thesis was to overcome these disadvantages by identifying the 2,5-hexanedione-reducing enzyme and then optimising (2S,5S)-hexanediol synthesis. Through an activity-based and column-chromatographic purification of baker’s yeast, NADPH-dependent Gre2p was identified as the 2,5-hexanedione-reducing enzyme. Enantiopure (2S,5S)-hexanediol was synthesised on a laboratory-scale (20 mM) through in vitro biotransformation using recombinant Gre2p together with glucose dehydrogenase (GDH) for cofactor recycling. Due to increased enzyme amounts, reaction velocity and space-time yield (g∙L-1∙d-1) were higher in comparison to conventional synthesis. In addition, as a large quantity of recombinant enzyme was formed as insoluble and inactive protein (so-called “inclusion bodies”), expression of GRE2 in E. coli was further optimised. This was achieved by cloning a synthetic gene adapted to the bias of E. coli into a plasmid which reveals a lower copy-number than the pET-vector system. The enzyme thus produced revealed an approximately 600-fold increase in specific activity compared with wild-type cell-free extract. In contrast, homologous gene expression in the S. cerevisiae strain BY4741 resulted in only a 140-fold increase in Gre2p activity. With cell-free approaches, (2S,5S)-hexanediol was synthesised up to a concentration of 0.2 M with a space-time yield of 374 g∙L-1∙d-1. With an E. coli designer catalyst expressing genes for Gre2p and GDH, it was feasible to reduce even 0.5 and 1 M diketone with space-time yields of 572 and 361 g∙L-1∙d-1. This whole-cell system resulted in significantly better cell productivity and co-substrate yield than both conventional biotransformation via baker’s yeast and in vivo synthesis using the recombinant S. cerevisiae strain. Moreover, in-depth characterisation revealed that Gre2p also reduces the reduction of α- and β-diketones, leading to optically active hydroxy ketones and diols. To solve the three-dimensional structure of Gre2p, several screening and optimisation approaches were taken. Crystals of a Gre2p complex with NADP+ were grown using polyethylene glycol (PEG) 8000 as a precipitant. The diffraction resolution was 3.2 Å. In an attempt to identify new alcohol dehydrogenases, in silico screening based on the amino acid sequence of Gre2p was performed, resulting in the identification of a novel alcohol dehydrogenase (KpADH) from the yeast Kluyveromyces polysporus. The enzyme was shown to reduce a broad spectrum of carbonyl compounds and was successfully applied in the synthesis of several optically active compounds, such as (S)-2-pentanol or (R)-ethyl-3-methyl-2-hydroxybutanoate, which are important synthons for the production of anti-Alzheimer’s drugs and protease inhibitors, respectively. In summary, the findings presented in this thesis establish the basis for the production of (2S,5S)-hexanediol on a commercial-scale via biotransformation of 2,5-hexanedione using either isolated and recombinant enzyme or tailor-made cells. Moreover, Gre2p and a newly identified alcohol dehydrogenase were successfully applied in the synthesis of further valuable chiral building blocks. Die asymmetrische Synthese überführt prochirale Verbindungen in chirale. Letztere sind wichtige Schlüsselbausteine bei der Herstellung von Pharmazeutika und Fein- sowie Agrochemikalien. In diesem Zusammenhang ist auch der Bedarf an enantiomerenreinem (2S,5S)-Hexandiol sehr hoch. Die Verbindung wird durch eine zweistufige Reduktion aus 2,5-Hexandion gewonnen. Die chemische Herstellung ist sowohl ökonomisch als auch ökologisch unzureichend, im Wesentlichen, aufgrund niedriger Atomökonomie, der Bildung von Nebenprodukten, extremen Reaktionsbedingungen und dem Bedarf an hochpreisigem sowie toxischem Übergangsmetallkatalysator. Gegenwärtig gibt es nur eine wirtschaftlich interessante biokatalytische Synthesemethode: Die Biotransformation des γ-Diketons durch Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae). Da aber nur geringe Mengen des verantwortlichen Enzyms in der Zelle vorhanden sind, ist die Zellproduktivität niedrig, so dass eine niedrige Reaktionsgeschwindigkeit resultiert. Um dem entgegenzuwirken, sollte in dieser Doktorarbeit das 2,5-Hexandion-reduzierende Enzym identifiziert und anschließend die (2S,5S)-Hexandiol-Synthese mit rekombinantem Enzym optimiert werden. Nach einer aktivitätsbasierten und säulenchromatographischen Reinigung der Bäckerhefe wurde die NADPH-abhängige Alkoholdehydrogenase Gre2p als das 2,5-Hexandion-reduzierende Enzym identifiziert. Enantiomerenreines (2S,5S)-Hexandiol konnte im Labormaßstab (20 mM) durch in vitro Biotransformation mit isoliertem, rekombinantem Enzym und Glukosedehydrogenase (GDH), die zur Cofaktorregenerierung eingesetzt wurde, synthetisiert werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit als auch die Raumzeitausbeute (g∙L-1∙d-1) konnten im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren um ein Vielfaches gesteigert werden, was der Bereitstellung größerer Enzymmengen zuzuschreiben ist. Da ein größerer Anteil an rekombinantem Enzym als unlösliches, inaktives Protein, sog. „Inclusion bodies“ gebildet wurde, wurde in der Folge die Expression das entsprechende Gens GRE2 in Escherichia coli weiter optimiert. Dies wurde durch Verwendung eines synthetischen Gens mit adaptierter E. coli Codon Usage in ein Plasmid, das im Vergleich zum pET-Vektorsystem eine geringere Kopienzahl besitzt, erzielt. Das auf diese Weise produzierte Enzym zeigte eine etwa 600-fach höhere spezifische Aktivität als der Rohextrakt des Wildtyps. Im Gegensatz dazu führte die homologe Expression im S. cerevisiae Stamm BY4741 nur zu einer 140-fach erhöhten Gre2p Aktivität. In zellfreien Ansätzen konnte (2S,5S)-Hexandiol bis zu einer Konzentration von 0,2 M mit einer Raumzeitausbeute von 374 g∙L-1∙d-1 synthetisiert werden. Mit Hilfe eines rekombinanten E. coli-Ganzzellkatalysators, der neben dem Gen für Gre2p auch das für die GDH co-exprimiert (sog. „Designer-Zellen“), konnten sogar 0,5 und 1 M Diketon mit 572 und 361 g∙L-1∙d-1 reduziert werden. Dieses Ganzzellsystem war in Raumzeitausbeute, Zellproduktivität und Co-Substrat-Verbrauchsrate nicht nur wesentlich besser als die herkömmliche Biotransformation mit Bäckerhefe, sondern übertraf auch die in vivo Synthese mit dem rekombinant hergestellten S. cerevisiae-Stamm. Es konnte außerdem durch detaillierte Charakterisierung des Gre2p-Enzyms gezeigt werden, dass es in der Lage ist, auch die Reduktion von α- und β-Diketonen zu katalysieren. Hierbei wurden sowohl nahezu optisch reine Hydroxyketone als auch Diole erzielt. Zur Aufklärung der 3D-Struktur von Gre2p wurden mehrere Screening- und Optimierungsansätze durchgeführt. Kristalle eines Gre2p-NADP+-Komplexes wuchsen in Gegenwart des Präzipitats Polyethylenglycol (PEG) 8000. Die Röntgenstrukturanalyse erbrachte eine Auflösung von 3,2 Å. Basierend auf der Aminosäuresequenz von Gre2p wurde ein in silico Screening durchgeführt, das zur Identifikation einer neuen Alkoholdehydrogenase aus der Hefe Kluyveromyces polysporus führte. Es zeigte sich, dass das Enzym in der Lage ist, ein breites Spektrum von Carbonylverbindungen zu reduzieren. Es wurde zudem erfolgreich zur Synthese einer Vielzahl optisch aktiver Verbindungen, wie z.B. (S)-2-Pentanol oder (R)-Ethyl-3-methyl-2-hydroxybutanoate, die wichtige chirale Synthons für die Herstellung von Anti-Alzheimer Medikamenten bzw. Protease-Inhibitoren sind, eingesetzt. Zusammenfassend lässt sich sagen, das die hier erzielten Ergebnisse eine Grundlage für die Synthese von (2S,5S)-Hexandiol im industriellen Maßstab schaffen. Dabei kann die Biotransformation von 2,5-Hexandion entweder mit Hilfe von isoliertem, rekombinantem Enzym oder mit Designer-Zellen erfolgen. Des Weiteren konnten Gre2p und eine neu-identifizierte Alkoholdehydrogenase erfolgreich in der Synthese weiterer hochwertiger chiraler Schlüsselbausteine eingesetzt werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	05.07.2016
Dateien geändert am:	05.07.2016
Promotionsantrag am:	24.10.2014
Datum der Promotion:	10.07.2015