Dokument: Strukturbasierte Studien von FMN-bindenden fluoreszierenden LOV Proteinen und ihre Anwendung als optogenetische Werkzeuge
| Titel: | Strukturbasierte Studien von FMN-bindenden fluoreszierenden LOV Proteinen und ihre Anwendung als optogenetische Werkzeuge | |||||||
| Weiterer Titel: | Structure Based Studies on FMN-Binding Fluorescent LOV Proteins and Their Application as Optogenetic Tools | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38838 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170725-084931-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | MSc Röllen, Katrin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Batra-Safferling, Renu [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das kontinuierlich wachsende Feld der Optogenetik nimmt eine immer stärker werdende Rolle in verschiedenen Bereichen der Naturwissenschaften, unter anderem der Biotechnologie und Biomedizin, ein. In den letzten Jahren wurden vor allem licht-aktivierbare Vertreter der Familie der Light, Oxygen, Voltage (LOV) Proteinfamilie auf ihre Anwendbarkeit als optogenetisches Werkzeug hin untersucht. LOV Domänen leiten durch Lichteinstrahlung ausgelöste Signale zu unterschiedlichen Effektordomänen weiter. Ein detailliertes Wissen über diese Interaktion zwischen Sensor- und Effektormolekülen ist von großer Bedeutung um optogenetische Werkzeuge zu designen. Dazu ist es nötig die einzelnen Schritte der Signalaufnahme- und Weiterleitung auf molekulare Ebene zu charakterisieren und verstehen. Darauf beruhend ist ein Hauptaspekt dieser Arbeit die Strukturanalyse von Kurz-LOV Proteinen mittels Röntgenkristallstrukturanalyse und Kleinwinkel-Röntgenstreuung.
In dieser Arbeit wurden die Kurz-LOV Proteine PpSB1-LOV aus Pseudomonas putida und DsLOV aus Dinoroseobacter shibae und ihre Mutanten (PpSB1-LOV-C53A, PpSB1-LOV-R66I, PpSB1-LOV-R61H/R66I, DsLOV-M49S, DsLOV-M49I, DsLOV-C72A) strukturell charakterisiert. Ein Vergleich der Lichtstruktur und der in dieser Arbeit bestimmten Dunkelstruktur von PpSB1-LOV zeigt eine Konformationsänderung der C-terminalen Jα Helix, eine veränderte Organisation der einzelnen Moleküle im Dimer zueinander und Veränderungen der Chromophorkoordination. Die oben genannte Signalweiterleitung in LOV Proteinen wird initiiert durch die Bestrahlung mit Blaulicht und der darauffolgenden Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Cys53-Sγ und dem C4a Atom des Flavinmononukleotid (FMN). Konformationsänderungen der Aminosäuren Seitenketten, vor allem des Gln116 in der Kernregion, induziert die beobachteten Änderungen von PpSB1-LOV, wodurch das Signal zu den äußeren Bereichen des Proteins weitergeleitet werden kann. Diese Ergebnisse werden durch Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) Daten unterstützt. Die Struktur der Mutante PpSB1-LOV-C53A, bei welcher der Austausch des photoaktiven Cysteins einen permanent fluoreszierenden Photosensor generiert, stimmt mit der Dunkelstruktur des Wildtyps überein. Ein Vergleich der Struktur von Licht- und Dunkelzustand mit der sogenannten belichteten Struktur zeigt, dass Erkenntnisse über strukturelle Änderungen auch aus belichteten Strukturen gewonnen werden können. Zusätzlich ist in dieser Arbeit die Struktur der Mutante PpSB1-LOV-R61H/R66I im Dunkelzustand bestimmt worden. In PpSB1-LOV wurden Arg61 und Arg66 als diejenigen Aminosäuren identifiziert, die zusätzlich zu den konservierten Argininen (Arg54 und Arg70) die Phosphatgruppe des FMN koordinieren. Diese vierfache Koordination hat einen ausschlaggebenden Anteil an der langsamen Rückkehr des Proteins in den Dunkelzustand. Die Kristallstruktur zeigt, dass die verbliebenen zwei Arginine die Koordinierung des FMN-Phosphatrestes ausgleichen. Ein Vergleich von Aminosäuren Sequenzen verschiedener LOV Proteine zeigt, dass bei DsLOV an Position 49 ein Methionin liegt, welche in anderen LOV Proteinen durch ein Leucin oder Isoleucin besetzt ist. Ein Austausch dieser Aminosäure mit einem Isoleucin und einem Serin bewirkt einen deutlichen Unterschied der Rückkehrzeit in den Dunkelzustand. Für den Wildtyp wurde ein Zeitkonstante von τREC = 9.6 s beobachtet. Der Austausch in ein Isoleucin verlangsamt die Rückkehrreaktionszeit zu τREC = 153 s, wohingegen der Austausch in ein Serin die Reaktion beschleunigt mit τREC = 1.1 s. In der Literatur wurden diese Unterschiede mit sterischen Effekten begründet. Die Seitenkette des Isoleucins hat einen starken abschirmenden Effekt auf die kovalente Bindung (siehe oben) wobei außerdem die Deprotonierung des N5-Atoms des FMN verlangsamt wird. Die kleinere Seitenkette des Serins hingegen hat einen schwächeren abschirmenden Effekt, wodurch die Rückkehr in den Dunkelzustand beschleunigt wird. Die Kristallstruktur der Mutante DsLOV-M49S konnte in dieser Arbeit ebenfalls bestimmt werden und zusätzliche Hinweise liefern, um den oben beschriebenen Unterschied der Zeitkonstante in der Rückkehr in den Dunkelzustand zu erklären. Weiterhin wurde die Struktur der Mutante DsLOV-C72A in dieser Arbeit bestimmt, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Diese Mutante wird zurzeit auf die Anwendbarkeit als Fluoreszenzreporter geprüft. Vor kurzem wurde die Kristallstruktur des Wildtyps publiziert. Dabei konnte ein Dimer identifiziert werden, das durch N-terminale Sekundärstrukturelemente bestehend aus zwei Schleifen und einer Helix (sogenannter „Ncap“) gebildet wird. Die Kristallstruktur der Mutante DsLOV-M49I hingegen zeigt einen Dimer, der durch Interaktionen zwischen Aminosäuren gebildet wird, die im konservierten β-Faltblatt zu finden sind.The growing field of optogenetics is the focus of current scientific areas such as in biotechnology and biomedicine. Application of optogenetic tools has made spatiotemporal control of several biological processes now possible. Recent research has focused on employment of photoactivatable proteins from the Light-Oxygen-Voltage (LOV) family, where LOV domains represent the photo-responsive domains that mediate sensory responses to various signal transduction domains. In order to design LOV-based optogenetic devices, it is essential to gather a detailed knowledge of allosteric communication between the LOV sensor and effector domains. For this, characterization of all relevant signaling states is required at molecular level. The main objective of this thesis is the structural analysis of full-length short LOV proteins, for which X-ray crystallography and small angle X-ray scattering (SAXS) methods were employed. In this thesis, two LOV proteins PpSB1-LOV from the soil bacteria Pseudomonas putida, and DsLOV from the marine bacteria Dinoroseobacter shibae and their respective mutants are characterized. The LOV protein PpSB1-LOV has been previously characterized biochemically and photochemically, and the light state structure was already published. The dark state crystal structure is determined in this thesis and structural comparison of both the states is performed. Large conformational change in the C-terminal helix Jα, a different dimer organisation, combined with differences in coordination of the chromophore enabled prediction of the signal propagation in PpSB1-LOV. This signal transfer is induced by illumination with blue light, subsequent absorption of a photon and the formation of a covalent bond between the Sγ atom of the photoactive cysteine and the C4a atom of the FMN chromophore. A conformational change of key amino acid side chains in the LOV core domain, in particular of Gln116, induces a reorientation of the C-terminal helix propagating the signal to the outer regions of the protein. Subsequently, this is directed towards a putative effector domain. Extended SAXS experiments in solution supported the obtained results. The same structural rearrangements are observed for PpSB1-LOV-C53A in which the photoactive cysteine was substituted into an alanine thus generating a protein which is unable to undergo photoactivation, and is permanently fluorescent. The comparison of the PpSB1-LOV structures in dark, light and illuminated states provide further insights into the light-induced activation and signal propagation in SB1-LOV protein. Furthermore, two additional arginines (Arg61 and Arg66) coordinating the phosphate of the chromophore were previously identified to be partly responsible for the slow dark recovery of PpsB1-LOV. Crystal structure of PpSB1-LOV-R61H/R66I in dark state shows that coordination of the phosphate moiety is compensated by the remaining conserved arginines. The second short LOV protein DsLOV consist a methionine at position 49, which is usually occupied by a leucine or isoleucine in other LOV protein sequences. Substitution of the methionine into an isoleucine and a serine has a severe influence on the dark recovery. The wildtype exhibits a recovery time of τREC = 9.6 s and is accelerated in the DsLOV-M49S mutant to τREC = 1.1 s and decelerated in DsLOV-M49I to τREC = 153 s. The crystal structures in dark state of both mutants reveal a change in steric interaction as the possible origin for these differences. The isoleucine shields the covalent bond suppressing deprotonation of the N5, whereas the serine enhances this protonation due to its smaller size. In addition, a different dimer interface as published for the wildtype structure is observed in the crystal structure of DsLOV-M49I. In case of wildtype DsLOV, the N-terminal cap mediates formation of the dimer. This N-cap region is not observed in DsLOV-M49I, most likely due to higher flexibility in this region. Instead, the dimer is formed by residues in the β-sheet of the conserved LOV core domain. Crystal structure of DsLOV-C72A is also determined that shows high similarity to the wild type DsLOV in dark state, and is currently being applied as a fluorescence reporter. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.07.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 25.07.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.07.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 04.04.2016 |
