Dokument: Charakterisierung einer neuen bakteriellen Laccase und deren Anwendung in einer multi-enzymatischen Kaskade zur Synthese von Lignanen

Titel:	Charakterisierung einer neuen bakteriellen Laccase und deren Anwendung in einer multi-enzymatischen Kaskade zur Synthese von Lignanen
Weiterer Titel:	Characterization of a novel bacterial laccase and its application in a multi-enzymatic cascade for the synthesis of lignans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38782
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160628-092139-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ricklefs, Esther [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 34,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.06.2016 / geändert 23.06.2016
Beitragende:	Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Biokatalyse, Laccase, Multikupferoxidase, Corynebacterium glutamicum, Phenolkupplung, C-C-Kupplung, C-O-Kupplung, Dimerisierung, Cu(I)-Oxidation, Redoxpotential, Vanillylalkoholoxidase, Pinoresinolreduktase, Pinoresinol/Lariciresinolreduktase, Eugenol, Coniferylalkohol, Pinoresinol, Lariciresinol, Secoisolariciresinol, Lignan, kinetische Racematspaltung, Eintopfsynthese, multi-enzymatische Kaskaden
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Laccasen (E.C. 1.10.3.2, Benzendiol/Sauerstoffoxidoreduktasen) gehören zur Gruppe der blauen Multikupferoxidasen und kommen in allen drei Domänen des Lebens vor. Sie katalysieren die Ein-Elektron-Oxidation von vier Substraten und koppeln diese an die Vier-Elektronen-Reduktion von Sauerstoff zu Wasser. Als Substrate dienen dabei verschiedenste Phenole, aromatische Amine, aber auch anorganische Ionen. Da Laccasen Sauerstoff als Cosubstrat benutzen und Wasser als einziges Nebenprodukt entsteht, handelt es sich um besonders „grüne“ Biokatalysatoren. Neben dieser Tatsache sind Laccasen aufgrund ihres breiten Substratspektrums für industrielle Anwendungen attraktiv; bisher werden allerdings lediglich Laccasen aus Pilzen für industrielle Prozesse eingesetzt. Gründe hierfür liegen darin, dass viele pilzliche Laccasen ein hohes Redoxpotential besitzen, gut charakterisiert und kommerziell erhältlich sind. Allerdings sind sie oftmals nur bei sauren Reaktionsbedingungen katalytisch aktiv. Im Gegensatz dazu sind bakterielle Laccasen im neutralen bis basischen pH-Bereich sowie bei höheren Temperaturen katalytisch aktiv. Zusätzlich sind sie oftmals stabiler gegenüber höheren Temperaturen, organischen Lösungsmitteln, Detergenzien und Laccaseinhibitoren. Ein weiterer Vorteil bakterieller Laccasen ist die Möglichkeit der einfachen Produktion im prokaryotischen Expressionssystem Escherichia coli. Derzeit sind ca. 1200 Gene in Prokaryoten als Laccasen annotiert, wodurch ein großer Pool an potentiell interessanten Biokatalysatoren zur Verfügung steht. Durch die biochemische Charakterisierung neuer bakterieller Laccasen mit unterschiedlichen Eigenschaften (z.B. Redoxpotential, pH- und Temperaturstabilität) kann das Wissen über diese Enzyme erweitert und damit das Potential für industrielle Anwendungen erhöht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue bakterielle Laccase aus Corynebacterium glutamicum (CgL1) kloniert, charakterisiert und ihr biotechnologisches Potential analysiert. Ein Substratscreening mit typischen und potentiellen Laccasesubstraten zeigte, dass CgL1 verschiedene phenolische Substrate oxidiert. Daneben katalysierte CgL1 die Oxidation von Cu+; dies weist auf eine physiologische Funktion im Bereich der Kupferhomöostase in C. glutamicum hin. CgL1 zeigte eine erhöhte Temperaturstabilität mit einer Halbwertszeit von 2 h bei 60°C. Des Weiteren ist CgL1 im neutralen bis alkalischen pH-Bereich mit 71 % bzw. 30 % Restaktivität nach 24 h stabiler als im sauren pH-Bereich. Die Zugabe von 40 – 50 % (v/v) an organischem Lösungsmittel hatte bei 50 % der getesteten Lösungsmittel nach 24 h keinen Einfluss auf die Enzymstabilität; im schlechtesten Fall lag die Restaktivität bei mindestens 55 %. Das Redoxpotential von CgL1 liegt bei 260 mV. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die Möglichkeit zum Einsatz von bakteriellen Laccasen in multi-enzymatischen Kaskaden zur Produktion von Feinchemikalien am Beispiel der Synthese des Lignans (±)-Pinoresinol gezeigt. Dabei wurde im ersten Schritt Eugenol, ein preiswertes und in großen Mengen verfügbares Substrat, von der Vanillylalkoholoxidase aus Penicillium simplicissimum (PsVAO) zu Coniferylalkohol oxidiert. Dieses unterlag im zweiten Schritt einer laccase-initiierten phenolischen Kupplung unter Bildung von (±) Pinoresinol. Aufgrund des pH-Optimums der PsVAO bei pH 10 wurde ein Enzymscreening zur Identifizierung von Laccasen, die Coniferylalkohol im neutralen bis basischen pH-Bereich oxidieren können, durchgeführt. Die Bildung von (±) Pinoresinol konnte dabei für alle getesteten bakteriellen Laccasen (CgL1, CotA, Ssl1, Tth) nachgewiesen werden, nicht jedoch für die kommerziell erhältliche pilzliche Laccase aus Trametes versicolor. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen der Kaskade konnten unter Verwendung der Enzyme PsVAO und CgL1 4,4 mM (1,6 g l-1) (±) Pinoresinol synthetisiert werden. Als besonders effektiv zeigte sich dabei die Verwendung der neu charakterisierten Laccase CgL1 mit geringem Redoxpotential und die Zugabe eines nicht-wassermischbaren organischen Lösungsmittels zur in-situ-Produktextraktion. Im semi-präparativen Maßstab wurde eine isolierte Ausbeute von 13 % Produkt erzielt. Durch Erweiterung der Kaskade um eine enantiospezifische Pinoresinol- bzw. Pinoresinol/Lariciresinolreduktase konnte aus dem produzierten Racemat enantiomerenreines Pinoresinol gewonnen werden. Da die eingesetzten Reduktasen NADPH-abhängig sind, wurde die Anwendung eines Ganzzellbiokatalysators etabliert und optimiert. Je nach Wahl der Reduktase konnte sowohl (+)- als auch (-) Pinoresinol mit ee-Werten von jeweils ≥ 99 % hergestellt werden. Als „Nebenprodukte“ der Racematspaltung entstanden die hochwertigen Lignane (-) Lariciresinol und (-) Secoisolariciresinol mit ee-Werten von 85 % bzw. ≥ 99 %. Das System wurde in einem semi-präparativen Maßstab durchgeführt und eine isolierte Ausbeute von 12 % enantiomerenreinem (+) Pinoresinol erzielt. Laccases (E.C. 1.10.3.2, benzenediol:oxygen oxidoreductases) belong to the group of blue multi-copper oxidases and occur in all three domains of life. They catalyze the one-electron oxidation of four substrates coupled to the four-electron reduction of oxygen to water. Various types of phenols, aromatic amines and inorganic ions are substrates for laccases. As they use oxygen as co-substrate and produce solely water as by-product, they are particularly green biocatalysts. In addition, their broad substrate spectrum makes laccases to promising candidates for industrial applications; but up to now exclusively fungal laccases are used in industrial processes. The reasons for this are that fungal laccases have higher redox potentials, are well-characterized and commercially available. However, they are mainly active at acidic reaction conditions. In contrast, bacterial laccases are active in the neutral to alkaline pH range as well as stable and active at elevated temperatures. Additionally, they exhibit higher stabilities against organic solvents and laccase inhibitors. A further advantage of bacterial laccases is that they can be produced in the prokaryotic expression system Escherichia coli. Presently, round about 1200 genes in prokaryotes are annotated as laccases, whereby a wide range of potentially interesting biocatalysts is available. The biochemical characterization of novel bacterial laccases with different properties (e.g. redox potential, pH- and temperature stability) enhances the knowledge about these enzymes and increases their potential for industrial applications. Within this work a novel bacterial laccase from Corynebacterium glutamicum was cloned, characterized, and its biochemical potential analyzed. A substrate screening with typical and potential laccase substrates revealed the oxidation of several phenolic substrates by CgL1. In addition, CgL1 catalyzed the oxidation of Cu+, which indicates a physiological role in the field of copper homeostasis in C. glutamicum. CgL1 showed stability at elevated temperatures with a half-life time of 2 h at 60°C. Moreover, CgL1 is in the neutral to alkaline pH-range with residual activities of 71 % and 30 %, respectively, after 24 h more stable than under acidic conditions. The addition of organic solvents had no influence on enzyme´s stability in 50 % of all tested solvents after 24 h incubation, in the worst case the residual activity was at least 55 %. The redox potential of CgL1 is 260 mV. The use of bacterial laccases in multi-enzymatic cascades for fine chemical production was first shown in this work exemplified by the synthesis of the lignan (±)-pinoresinol. In the first step eugenol, an abundant and low cost substrate, was oxidized to coniferyl alcohol by the vanillyl-alcohol oxidase from Penicillium simplicissimum (PsVAO) followed by a laccase initiated phenolic coupling to form (±)-pinoresinol. Since the pH-optimum of PsVAO is at pH 10 an enzyme screening was carried out to reveal laccases that are able to oxidize coniferyl alcohol in the neutral to alkaline pH-range. The formation of (±)-pinoresinol was observed for four tested bacterial laccases, but not for the commercially available fungal laccase from Trametes versicolor. After optimizing the reaction conditions of the one-pot process (employing PsVAO and CgL1) 4.4 mM (1.6 g l-1) (±)-pinoresinol were synthesized. Particularly effective was the application of the novel characterized laccase CgL1 with low redox potential, and the addition of a non-water miscible organic solvent for in situ product extraction. In a semi-preparative scale reaction an isolated yield of 13 % product was achieved. By the addition of an enantiospecific pinoresinol- or pinoresinol/lariciresinol reductase to the cascade enantiopure pinoresinol was gained from racemic mixture. Owing to the NADPH-dependence of the reductases, an application of a whole-cell catalyst was established and optimized. Depending on the reductase used (+)- and (-)-pinoresinol could be produced with ee-values of ≥99 %. As “side-products” of kinetic resolution the lignans (-)-lariciresinol and (-)-secoisolariciresinol were formed with ee-values of 85 % and ≥99 %, respectively. This system was performed in a semi-preparative scale and an isolated yield of 12 % of enantiopure (+)-pinoresinol was achieved.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	28.06.2016
Dateien geändert am:	28.06.2016
Promotionsantrag am:	15.10.2015
Datum der Promotion:	10.12.2015