Dokument: Structural analysis and aggregation of Alzheimer’s disease related pyroglutamate-modified amyloid-β

Titel:	Structural analysis and aggregation of Alzheimer’s disease related pyroglutamate-modified amyloid-β
Weiterer Titel:	Strukturanalyse und Aggregation des Alzheimer-Demenz betreffenden pyroglutamatmodifizierten Amyloid-β
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38337
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170518-103631-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dammers, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.05.2016 / geändert 17.05.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive decline of cognitive functions and has become the main cause for dementia in the elderly. Toxic extracellular amyloid-β (Aβ) plaques belong to the pathology of AD. N-terminally truncated pyroglutamate-modified Aβ (pEAβ) has been identified as a major compound of Aβ species in AD brains. The first well working expression and purification system for reproducible production of pEAβ isoforms is presented within this thesis. pEAβ(3-40) and pEAβ(3-42) were obtained in natural abundance as well as 13C and 15N isotopically enriched in qualities and quantities to perform reproducible biophysical studies. The chemical state of the purified protein was evaluated by RP-HPLC and formation of pyroglutamate was verified by mass spectroscopy. Recombinant pEAβ(3-40) and pEAβ(3-42) were characterized by ThT assay and showed typical sigmoidal aggregation kinetics. Heteronuclear multidimensional NMR spectroscopy was performed to assign sequence specific backbone resonances of the pEAβ peptides under near-physiological conditions at neutral pH. The structural difference between Aβ and the pyroglutamate-modified variant was investigated in the presence of the helix inducing co-solvent trifluoroethanol (TFE). In contrast to Aβ(1-40) and Aβ(1-42), both corresponding pEAβ peptides build twisted fibrils and large amyloidogenic aggregates in aqueous TFE solution shown by transmission electron microscopy (TEM). Aggregation kinetics of pEAβ variants were drastically increased compared to the non-modified Aβ as monitored by ThT assays. Although analysis of secondary structure obtained by NMR data suggests, that Aβ as well as pEAβ form mainly soluble monomers characterized by α-helices in two regions connected by a flexible linker, these monomers were shown to be unstable and prone to aggregate resulting in an accumulation into fibrils. Additional NMR and CD data indicate an increased tendency to build β-sheet structures for pEAβ(3-42) and pEAβ(3-40) in TFE when compared to the corresponding non-truncated variant under exactly the same conditions. There is evidence that pEAβ(3-42) builds TFE-induced transient α-helices as a precursor to β-sheet formation and fibrillation in the presence of TFE. Moreover, the pyroglutamate modification affects the N-terminal amino acid residues up to H13/H14 what are in fact roughly 30 % of the overall amino acids indicating that the altered N-terminus promotes TFE-induced aggregation. Based on this study, we could expose the knowledge of the structural difference of pyroglutamate-modified Aβ peptides and their aggregation behavior. However, there is need to further characterize and define the altered properties of pEAβ peptides especially with regard to its usage as new biomarkers and therapeutic approaches. Recombinant pEAβ(3-42) was used to characterized the effect of D3 and its head to tail tandem derivative D3D3 in vitro. Additionally in vivo studies in a pEAβ(3-42) expressing transgenic mouse model indicated the efficiency of D3 and D3D3. Treatment with both peptides showed to significantly slow down pEAβ-related progression of the neurodegenerative phenotype of transgenic mice. Thus, the D-enantiomeric peptides D3 and D3D3 are promising candidates for treatment and therapy of AD. Die Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, deren Symptome durch eine fortschreitende Abnahme der kognitiven Funktionen gekennzeichnet sind. Sie gilt als Hauptursache für Demenz. Toxische extrazelluläre Amyloid-β (Aβ) Plaques gehören zur Pathologie der Alzheimer Krankheit. N-terminal modifiziertes Pyroglutamat Aβ (pEAβ) gilt als eine wichtige Spezies im Gehirn von Alzheimer-Erkrankten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine reproduzierbare Methode für die Expression und Reinigung rekombinanter Pyroglutamat-modifizierter Amyloid-β (pEAβ) Peptide entwickelt. Es war möglich, die N-Terminal modifizierten Peptide sowohl in mit als auch ohne 13C- und 15N-Isotopenanreicherung zu gewinnen. Die durch die Umsetzung zu Pyroglutamat chemische Änderung der Peptide wurde mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie überprüft. pEAβ(3-40) und pEAβ(3-42) wurden auf ihr Aggregationsverhalten hin untersucht und zeigten eine für amyloidogene Peptide typische sigmoidale Aggregationskinetik. Mittels heteronuklearer multidimensionaler NMR Spektroskopie war es möglich die Resonanzen des Proteinrückgrates unter annähernd physiologischen Bedingungen zuzuordnen und mit dem nicht-modifiziertem Aβ zu vergleichen. Der strukturelle Unterschied zwischen Aβ und den Pyroglutamat-modifizierten Varianten wurde weiterhin in Gegenwart des sekundärstrukturinduzierendem Lösungsmittels Trifluorethanol (TFE) charakterisiert. Im Gegensatz zu Aβ(1-40) und Aβ(1-42) bilden beide korrespondierenden pEAβ-Peptide in TFE mikroskopisch sichtbare gedrehte Fibrillen und große amyloidogene Aggregate aus. Außerdem zeigen die pEAβ Peptide eine sigmoidale Aggregationskinetik unter Bedingungen bei denen die nicht-modifizierten Aβ peptide keine fibrillären Strukturen ausbildet. Zirkulardichroismus (CD) Daten zeigen, dass die Tendenz zur Bildung von β-Faltblättern in TFE für pEAβ im Vergleich zum nicht-modifiziertem Aβ stark erhöht ist. So wurde mittels CD beobachtet, dass pEAβ, unter Bedingungen bei denen der Aβ ausschließlich α-helikale Strukturen zeigt, β-Faltblätter bildet. Die Sekundärstrukturanalyse auf Basis der NMR Daten zeigte allerdings ausschließlich lösliche jedoch instabile α-helikale Monomere, welche innerhalb weniger Stunden aggregierten. Es ist möglich, dass pEAβ TFE induzierte transiente α-Helices bildet, die einen Übergangszustand zu β-Faltblättern und daraus folgenden Fibrillen darstellen. Da die Bildung zu Pyroglutamat die chemische Verschiebung der N-Terminalen Aminosäuren bis zu Histidin13 / Histidin14 beeinflusst, gibt es Grund zu der Annahme, dass der veränderte Aminoterminus die TFE-induzierte Aggregation begünstigt oder sogar initiiert. Es konnten Einblicke bezüglich des strukturellen Unterschiedes basierend auf der N-terminalen Modifizierung zu Pyroglutamat gemacht werden. Die Charakterisierung der pEAβ Peptide und ihr erhöhtes Aggregationspotenzial ist ein wichtiger Schritt für die Erforschung der Alzheimer-Demenz - vor allem im Hinblick auf die Entwicklung neuer Biomarker und therapeutischer Ansätze. Aus diesem Grunde wurde rekombinantes pEAβ(3-42) genutzt, um das Aβ-bindende D-enantiomere Peptid D3 und sein tandem-Derivat D3D3 in vitro zu charakterisieren. Zusätzliche in vivo Studien zeigten die Wirksamkeit beider D-Peptide in pEAβ(3-42) exprimierenden transgenen Mäusen. D3 und D3D3 konnten die im Zusammenhang mit pEAβ induzierte Fortschreitung des neurodegenerativen Phänotyps signifikant verzögern und sind somit vielversprechende Kandidaten für eine medikamentöse Behandlung der Alzheimer-Demenz.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » NMR - Spektroskopie biologischer Makromoleküle
Dokument erstellt am:	18.05.2017
Dateien geändert am:	18.05.2017
Promotionsantrag am:	18.09.2015
Datum der Promotion:	21.10.2015