Dokument: Secondary Metabolites from Fungi: Natural Product Diversity, Structure Elucidation and Bioactivity
| Titel: | Secondary Metabolites from Fungi: Natural Product Diversity, Structure Elucidation and Bioactivity | |||||||
| Weiterer Titel: | Sekundärstoffe aus Pilzen - Vielfalt, Strukturaufklärung und Bioaktivität von Naturstoffen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38254 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160509-083422-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M.Sc. Chen, Huiqin [Autor] | |||||||
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| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Diese Dissertation beschreibt Sekundärstoffe, die aus verschiedenen Pilzstämmen, wie beispielsweise Trichoderma harzianum, Aspergillus terreus, Penicillium sp. (Stämme IO1 und IO2), Alternaria alternata, Penicillium paxilli und Penicillium sclerotiorum isoliert wurden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit Hilfe spektroskopischer Methoden, wie der Massenspektrometrie (MS) und der Kernspinmagnetresonanzspektroskopie (NMR). Die absolute Konfiguration chiraler Substanzen wurde durch Vergleich der optischen Rotation mit Literaturwerten oder durch ECD Spektroskopie bestimmt. Um die maximale chemische Diversität an sekundären Metaboliten aus den Pilzen zu erhalten, wurden verschiedene Kultivierungsmethoden durchgeführt. Die bekanntesten Methoden beinhalten die Änderung des Mediumtyps oder des pH-Werts, um die Biosynthese bestimmter Metabolite zu aktivieren, so dass diese entsprechend produziert werden.
Es wird davon ausgegangen, dass mikrobielle Interaktionen der wichtigste Faktor sind, um die Produktion von bioaktiven Sekundärmetaboliten anzuregen. Deshalb wurden Co-Kultivierungsversuche durchgeführt, um die natürliche Umgebung in der Natur nachzuahmen und mit dem Ziel, stille Biosynthese-Gencluster zu aktivieren. Zudem wurden epigenetische Modifikationen durchgeführt, um die Induktion von neuen sekundären Metaboliten zu fördern, indem Histon-Deacetylasen (HDAC) oder DNA-Methyltranferasen (DMAT) inhibiert wurden. Diese Dissertation enthält folgende Kapitel: 1. Trichoderma harzianum Der endophytische Pilz T. harzianum wurde aus den Blättern von Cola nitida isoliert. Aus der ersten Fermentation auf Reismedium wurde der neue Naturstoff 4‘-Hydroxy-deacetyl-18-deoxycytochalasin H (1) und die bekannten Verbindungen Deacetyl-18-deoxycytochalasin H (2), 18-Deoxycytochalasin (3) und Alternariol (4) erhalten. Die zweite Fermentation ergab die bekannten Substanzen Waol (5) und Aspyridon A (6). Die Struktur des neuen Naturstoffs 1 wurde mit Hilfe von 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie, HRESIMS Messungen und Literaturvergleichen bestimmt. Die Substanzen 1-3 zeigten starke zytotoxische Aktivitäten gegenüber der Mauslymphomzelllinie L5178Y und der menschlichen Ovarialkrebszelllinie A2780 sens und A2780 CisR (IC50 0,19-6,97 µM). Die A2780 Zelllinie beinhaltet sowohl die Cisplatin sensitiven (sens) als auch resistenten (CisR) Zellen. 2. Aspergillus terreus Der in der Erde lebende Pilz A. terreus wurde aus einer Sedimentprobe des Wadi El Natrun Sees in Ägypten isoliert. Die Co-Kultivierung von A. terreus mit den Bakterienstämmen Bacillus subtilis und Bacillus cereus auf Reismedium resultierte in einer bis zu 34-fachen Erhöhung der Naturstoffproduktion der Pilze (10-21) im Vergleich zur axenischen Kultivierung des Pilzes. So wurden zwei neue Butyrolacton-Derivate Isobutyrolacton II (7) und 4-O-Demethylisobutyrolacton II (8) und die bekannte Verbindung N-(Carboxymethyl)anthranilsäure (9) gewonnen. Substanz 9 konnte nur in der Co-Kultivierung mit B. subtilis oder mit B. cereus isoliert werden. In der axenischen Kultur des Pilzes wurde sie nicht nachgewiesen. Die Kulturen von A. terreus auf Reis-, flüssigem Wickerham- und Bohnenmedium wurden mittels HPLC untersucht. Neben neun verschiedenen Substanzen, die aus der Reiskultur isoliert wurden, wurden das Stereoisomerenpaar Dihydroisoflavipucin (22) und (23) aus der Wickerham-Flüssigkultur und Asterrelenin (29) und Acetylaszonalenin (30) aus der Bohnenkultur erhalten. Substanzen 11 und 20 bewirkten eine schwache Inhibition gegenüber B. cereus mit einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 150,9 und 216,2 μM, während 14 eine moderate Zytotoxizität gegenüber der Mauslymphomzelllinie L5178Y zeigte. Bei einer Dosis von 10 µg/mL wurde die Wachstumsrate um 80 % inhibiert. 3. Penicillium sp. Stämme IO1 und IO2 Der aus dem mediterranen marinen Schwamm Ircinia oros isolierte Pilz Penicillium sp. (Stamm IO1) brachte ein neues Fusarielin Analogon (31) und die bekannten Substanzen Griseofulvin (32) und Dechlorogriseofulvin (33) hervor. Die absolute Konfiguration von 31 wurde auf der Basis von TDDFT ECD Berechnungen ermittelt. Aus einer weiteren Penicillium-Art (Stamm IO2), ebenfalls aus dem Schwamm I. oros isoliert, wurden die bekannten Substanzen Dehydrocurvularin (34), Curvularin (35) und Trichodimerol (36) erhalten. Bei der Co-Kultivierung von beiden Penicillium-Stämmen IO1 und IO2 wurde die Bildung der bekannten Naturstoffe Norlichexanthon (37) und Monocerin (38) induziert, die unter axensischen Bedingungen in den Kontrollkulturen nicht produziert wurden. Griseophenon B (39) und Echinulin (40) wurden ebenfalls nach Co-Kultivierung isoliert, wobei sie aufgrund der geringen Menge nicht im HPLC detektierbar waren. Die Naturstoffe 39 und 40 zeigten eine deutliche Zytotoxizität gegenüber der Mauslymphom-Zelllinie L5178Y mit IC50-Werten von 8,4 bzw. 4,7 µM. 4. Alternaria alternata Alternaria alternata wurde aus Blättern der Regenwaldpflanze Antiaris africana, die in Kamerun gesammelt wurden, isoliert. Aus dem Ethylacetat-Extrakt der Fermentation auf Reis wurden die fünf bekannten Substanzen (5S)-Altersetin (41), Altersetin-2 (42), Altertoxin II (43), Altertoxin I (44) und Tenuazonsäure (45) isoliert, wobei 41 und 42 ein Stereoisomerenpaar sind. Zusätzlich wurde die neue Substanz Methyl-2-carboxy-3-hydroxy-(E)-cinnamat (46) isoliert, welche allerdings in Methanol graduell zu 47 zyklisiert. 5. Penicillium paxilli Penicillium paxilli wurde aus der gleichen Bodenprobe isoliert wie A. terreus. Es wurden zehn bekannte Naturstoffe, darunter acht Paxilline und zwei Pyrenocine, aus Reiskulturen isoliert. Interessanterweise wurde die Produktion von zwei Pyronen induziert, indem Pflanzenmaterial der Wirtspflanze dem Reismedium beigemischt wurde. Bioaktivitätstests zeigten zytotoxische Aktivitäten von Dehydroxypaxillin (49), Pyrenocin B (56) und Pyrenocin A (57) gegenüber der Mauslymphomzelllinie L5178Y mit IC50-Werten von 6,7, 4,9, bzw. 1,1 µM. Gegenüber der humanen Zelllinie A2780 sens zeigten Dehydroxypaxillin (49) und Paspain (52) eine Inhibition mit IC50-Werten von 6,4 bzw. 3,2 µM, während 10β-Hydroxy-13-desoxypaxillin (51), Pyrenocin B (56) und Pyrenocin A (57) einen moderaten inhibitorischen Effekt mit IC50-Werten von 24,5, 73,4 bzw. 22,0 µM aufwiesen. 21-Isopentenylpaxallin (50) zeigte eine schwache Inhibition mit einem IC50-Wert von 105,6 μM. Zudem war Paxillin (49) die einzige Substanz, die mit einem IC50-Wert von 1.1 μM gegenüber der Zelllinie A2780 CisR eine gute zytotoxische Aktivität besaß. Co-Kultivierungsversuche von P. paxilli mit Bakterien (B. subtilis, B. cereus, S. coelicolor oder S. lividans) führten nicht zur Induktion von pilzlichen Naturstoffen. 6. Penicillium sclerotiorum P. sclerotiorum wurde aus der Mangrove Aegialitis annulata isoliert. Es wurden fünf Substanzen aus diesem Pilz gewonnen. Dazu gehörten (+)-Isorotiorin (60), (+)-Sclerotioin (61), (+)-Isochromophilon VI (62), Isoharziansäure (63) und Harziansäure (64).This dissertation describes secondary metabolites isolated from different fungi, including Trichoderma harzianum, Aspergillus terreus, Penicillium sp. (strains IO1 and IO2), Alternaria alternata, Penicillium paxilli and Penicillium sclerotiorum. The structures of isolated compounds were elucidated by analysis of MS and NMR data. The absolute configuration of chiral compounds was determined by comparison of the optical rotation with the literatures and by ECD spectroscopy. In order to exploit the maximal chemical diversity of fungi, several cultivation methods were applied. The most common ways included the alteration of the medium type, salinity or pH to elicit the biosynthesis of specific metabolites, so that the corresponding metabolites were produced. Microbial interaction was considered to be the most important factor for triggering the production of bioactive secondary metabolites, and thus co-cultivation approaches were pursued to mimic the natural environment with the aim to activate silent gene clusters of axenic cultures. In addition, epigenetic modifiers were used to attempt the induction of new secondary metabolites by inhibition of histone deacetylases (HDACs) and DNA methyltransferases (DMATs). This dissertation consists of the following parts: 1. Trichoderma harzianum The endophytic fungus T. harzianum was isolated from leaves of Cola nitida. One new natural product 4'-hydroxy-deacetyl-18-deoxycytochalasin H (1), together with the known deacetyl-18-deoxycytochalasin H (2), 18-deoxycytochalasin H (3) and alternariol (4) were obtained from the first fermentation on rice medium. The secondary fermentation gave the known compounds waol A (5) and aspyridone A (6). The structure of the new compound was unambiguously determined by 1D and 2D NMR spectroscopy, and by HRESIMS measurements, as well as by comparison of the data with the literature. Compounds 1-3 showed potent cytotoxicity against the murine lymphoma cell line L5178Y and the human ovarian cancer cell lines A2780 sens and A2780 CisR (IC50 0.19 - 6.97 μM). The A2780 cell lines included cisplatin-sensitive (sens) and -resistant (R) cells. 2. Aspergillus terreus The soil-dwelling fungus A. terreus was isolated from a sediment sample collected from the lake of Wadi EI Natrun in Egypt. Co-cultivation of A. terreus with the bacteria Bacillus subtilis or with Bacillus cereus on solid rice medium resulted in an up to 34-fold increased accumulation of constitutively present fungal natural products (10 ─ 21) compared to axenic cultures of A. terreus. The fungal products included two new butyrolactone derivatives, isobutyrolactone II (7) and 4-O-demethylisobutyrolactone II (8), together with the known N-(carboxymethyl)anthranilic acid (9) that were not present in axenic fungal controls and were only detected during co-cultivation with B. subtilis or with B. cereus. In a second set of co-cultivation experiments, A. terreus was co-cultured with Streptomyces lividans or with Streptomyces coelicolor. These co-cultivation experiments failed to induce the fungal natural product accumulation in contrast to co-cultures with Bacillus sp.. Cultivation of A. terreus on rice, in liquid Wickerham medium or on white beans, respectively, resulted in specific HPLC chromatograms. Nine compounds different from the rice culture were isolated, in addition to the pair of dihydroisoflavipucine stereoisomers 22 and 23 from liquid Wickerham medium, and asterrelenin (29) and acetylaszonalenin (30) from the bean culture. Butyrolactone II (11) and aspulvinone E (20) showed weak inhibition of B. cereus with minimal inhibitory concentrations (MICs) of 64 μg/ mL, respectively, while asterrelenin (29) showed weak inhibition of Mycobacterium tuberculosis with MIC 100 μg/ mL. For the results from cytotoxicity assays, terrein (14) showed moderate cytotoxicity with 80% inhibition of the murine lymphoma cell line L5178Y at a dose of 10 μg/ ml, while 29 and 30 showed weak cytotoxicity against human ovarian cancer A2780 sens cell line at the concentration of 102 μM. 3. Penicillium sp. strains IO1 and IO2 The marine-derived fungus Penicillium sp. strain IO1 isolated from the Mediterranean sponge Ircinia oros yielded a new fusarielin analogue (31), together with the known compounds griseofulvin (32) and dechlorogriseofulvin (33). The absolute configuration of 31 was determined on the basis of TDDFT ECD calculations. A further Penicillium sp. strain IO2 that was isolated from the same sponge I. oros yielded the known compounds dehydrocurvularin (34), curvularin (35), and trichodimerol (36). Co-cultivation of both Penicillium strains IO1 and IO2 was found to induce the accumulation of the known norlichexanthone (37) and monocerin (38) that were not detected in either of the two axenic fungal controls. Griseophenone B (39) and echinulin (40) were isolated incidentally from the co-culture, however, these two compounds were not observed in the HPLC chromatograms due to their small amounts. Compounds 34 and 38 showed pronounced cytotoxicity against the murine lymphoma cell line L5178Y with IC50 values of 4.7 and 8.4 μM, respectively. 4. Alternaria alternata A. alternata was isolated from leaves of the rainforest plant Antiaris africana collected in Cameroon. From the ethyl acetate extract of fermentations on rice, six compounds were isolated, with a pair of altersetin tautomers 41 and 42. The new compound methyl 2-carboxy-3-hydroxy-(E)-cinnamate (46) gradually cyclized to 47 in MeOH. 5. Penicillium paxilli P. paxilli had the same origin as A. terreus, isolated from a sediment sample collected from the lake of Wadi EI Natrun in Egypt. Ten known compounds, including eight paxillines and two pyrenocines, were isolated from rice cultures. Interestingly, the production of two pyrones was induced when cultured in an over-autoclaved plant mixed rice medium. Bioactivity tests showed cytotoxic activities of dehydroxy paxilline (49), pyrenocine B (56) and pyrenocine A (57) against L5178Y with IC50 values of 6.7, 4.9 and 1.1 μM, respectively. When assayed against A2780 sens, dehydroxy paxilline (49) and paspaline (52) caused pronounced inhibition with IC50 values of 6.4 and 3.2 μM, respectively, 10β-hydroxy-13-desoxy paxilline (51), pyrenocine B (56) and pyrenocine A (57) had moderate inhibitory effect with IC50 24.5, 73.4 and 22.0 μM, while 21-isopentenylpaxilline (50) showed a weak inhibition with IC50 105.6 μM. In addition, 49 was the only compound that showed inhibition against A2780 CisR cells with IC50 1.1 μM. The co-cultivation experiments of P. paxilli with bacteria (B. subtilis, B. cereus, S. coelicolor or S. lividans) failed to induce any changes in fungal natural product accumulation. 6. Penicillium sclerotiorum P. sclerotiorum was isolated from the mangrove plant Aegialitis annulata. Five known compounds were isolated from this fungus, including (+)-isorotiorin (60), (+)-sclerotiorin (61), (+)-isochromophilone VI (62), isoharzianic acid (63) and harzianic acid (64). | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.05.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.05.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.04.2016 |
