Dokument: Differentiation and characterization of induced pluripotent stem cell derived astrocytes
| Titel: | Differentiation and characterization of induced pluripotent stem cell derived astrocytes | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38139 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170508-091833-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Garg, Pretty [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Gottmann, Kurt [Gutachter] Prof. Dr. Rose, Christine R. [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Stem cells, astrocytes, differentiation, GFAP, heterogeneity | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Previously, several studies have reported differentiation of astrocyte from human induced pluripotent stem cells using serum or CNTF or BMP and LIF in a time span of about six months due to the long culture time required for NSCs to attain gliogenic potential. Most of these studies focused on producing high GFAP expressing astrocytes, thereby leading to underappreciation of astrocyte heterogeneity.
In this study, NSCs were first characterized for their gliogenic potential by evaluating the expression of astrocyte restricted progenitor markers like CD44, NF1A, NF1B, NF1C, NF1X, EGFR and STAT3 at mRNA and protein level at different passages and culture conditions. Exposure to a high dose of the growth factors FGF or EGF was employed to render early NSCs gliogenic in a time span of only two months. Based on these results, NSCs of intermediate passage with high gliogenic potential were used for further differentiation. PD0325901, a small molecule inhibitor of the MEK pathway, previously used as a replacement for BMP and LIF to maintain mouse ES cultures, was employed as an innovative approach for astrocyte differentiation. The differentiation towards astrocytes after 14 days of PD treatment was assessed by analyzing the expression of astrocyte markers like S100β, GFAP, ALDH1L1, EAAT1, Acsbg1, GS, Cx43, ApoE and EAAT2 by quantitative PCR, western blotting or immunocytochemistry (ICC). Although, ICC revealed only a low percentage of high GFAP expressing cells, all other markers were found to be expressed, suggesting astrocyte identity of the low GFAP cells. Notably, high GFAP expressing cells could be differentiated from high passage NSCs using the same small molecule, which was probably due to the previously described epigenetic repression of the GFAP promotor in young NSCs. The cortical lineage of NSCs and differentiated astrocytes was confirmed by ICC using forebrain and hindbrain markers. Owing to the short differentiation time using the small molecule, it was important to investigate the functional maturity of the generated astrocytes. The low GFAP expressing cells elicited calcium transients in response to glutamate and ATP and were also able to take up glutamate. Exposure to the inflammatory agents TNFα and bacterial endotoxin LPS and to acidic pH turned these astrocytes reactive as shown by upregulation of reactivity markers like Serpina3n, Lcn2 and GFAP. The signaling pathway underlying PD mediated astrocyte differentiation was identified as PI3K dependent Akt1 phosphorylation, which on one hand lead to the upregulation and phosphorylation of STAT1/3 and on the other hand to the translocation of the astrocytic transcriptional repressor Olig2 from the nucleus to the cytoplasm. These data establish the use of a small molecule for MEK inhibition as a highly effective approach to generate distinct types of human astrocytes, which provide a platform to explore the role of astrocyte subtypes in brain physiology and pathology.Frühere Arbeiten haben die Differenzierung von Astrozyten aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einer Zeitspanne von etwa 6 Monaten unter der Verwendung von Serum, CNTF oder BMP und LIF gezeigt. Dem liegt vor allem der lang andauernde Prozess des Erwerbens von gliogenen Eigenschaften in neuralen Stammzellen (NSZ) zu Grunde. Die meisten dieser Studien fokussieren außerdem auf die Erzeugung von stark GFAP exprimierenden Astrozyten und führen dadurch zu einer Vernachlässigung der Astrozytenheterogenität. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst NSZ auf ihre gliogenen Eigenschaften untersucht. Dazu wurde die Expression von Astrozyten-Vorläufer-Markern wie NF1A, NF1B, NF1C, NF1X, EGFR, STAT3 und CD44 auf mRNA- und Protein-Ebene zu unterschiedlichen Kultivierungszeitpunkten und unter verschiedenen Kulturbedingungen analysiert. Die Behandlung von frühen NSZ mit hohen Konzentrationen der Wachstumsfaktoren FGF-2 oder EGF führte innerhalb von 2 Monaten zu einer Induktion von gliogenen Eigenschaften. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden gliogene NSZ mittlerer Passagenzahl für die weitere Differenzierung verwendet. PD0325901 (PD), ein niedermolekularer Inhibitor des MEK Signalwegs, der bereits an Stelle von BMP und LIF bei der Kultivierung von embryonalen Stammzellen der Maus erfolgreich eingesetzt worden ist, wurde hier als innovativer Ansatz für die Astrozytendifferenzierung eingeführt. Die Differenzierung zu Astrozyten nach einer 14 tägigen PD Behandlung wurde anhand von Astrozyten-Markern wie S100β, GFAP, ALDH1L1, EAAT1, Acsbg1, GS, Cx43, ApoE und EAAT2 validiert. Deren Expression wurde mittels quantitativer PCR, Western Blot und Immunozytochmie (IZC) untersucht. Obwohl die IZC nur wenige stark GFAP exprimierende Zellen zeigte, konnte die Expression der anderen Marker bestätigt werden, was auf eine astrozytäre Identität der niedrig GFAP exprimierenden Zellen schließen lässt. Bemerkenswert ist auch die Beobachtung, dass derselbe MEK Inhibitor in höher passagierten NSZ zur Differenzierung von stark GFAP positiven Astrozyten führt. Dies lässt sich durch die bereits beschriebene epigentische Repression des GFAP Promotors in jungen NSZ erklären. Die kortikale Identität der NSZ und differenzierten Astrozyten ließ sich durch IZC mittels Vorderhirn- und Hirnstamm-Markern feststellen. Aufgrund der kurzen Differenzierungszeit mit dem niedermolekularen Inhibitor, war es wichtig, die funktionelle Ausreifung der Astrozyten zu untersuchen. Die niedrig GFAP exprimierenden Zellen reagierten auf Glutamat und ATP mit einer Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration und waren ebenfalls dazu in der Lage Glutamat aufzunehmen. Entzündungsauslösende Substanzen wie TNFα und das bakterielle Endotoxin LPS, wie auch eine Azidifizierung des extrazellulären Milieus führten zur Reaktivität der Astrozyten. Dies konnte durch eine Hochregulation der Reaktivitätsmarker Serpina3n, Lcn2 und GFAP gezeigt werden. Als Signalweg der PD induzierten Astrozytendifferenzierung konnte die PI3K vermittelte Phosphorylierung von Akt1 identifiziert werden. Diese führte sowohl zu einer Hochregulation und Phosphorylierung von STAT1/3 also auch zur Translokation des Astrozyten-Repressors Olig2 vom Zellkern ins Zytoplasma. Die Ergebnisse dieser Arbeit etablieren die Verwendung eines niedermolekularen MEK Inhibitors als hoch effektiven Ansatz zur Generierung von verschiedenen Typen menschlicher Astrozyten, welche als Plattform zur Untersuchung der Rolle von Astrozyten in der Physiologie und Pathologie des Gerhirns dienen können. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.05.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.05.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.12.2015 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.02.2016 |
