Dokument: Development and application of standard molecules for Aβ oligomer quantification in CSF and human blood plasma in the sFIDA assay.

Titel:	Development and application of standard molecules for Aβ oligomer quantification in CSF and human blood plasma in the sFIDA assay.
Weiterer Titel:	Entwicklung und Anwendung von Standardmolekülen für die Quantifizierung von Aβ-Oligomeren in CSF und humanem Blutplasma im sFIDA-Assay.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37860
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161221-134806-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kravchenko, Kateryna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,02 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.12.2016 / geändert 21.12.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Georg Groth [Gutachter]
Stichwörter:	Alzheimer's disease, Aβ oligomers, sFIDA, diagnosis, standard molecules, silica nanoparticles, blood plasma, CSF
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Alzheimersche Demenz (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die einer Schätzung zufolge im Jahr 2050 ca. 100 Mio. Personen betreffen wird. Zur Zeit gibt es weder eine pre mortem Diagnose noch eine ursächliche Therapie. Die Etablierung eines zuverlässigen Assays ist von großer Bedeutung für die Entwicklung von wirksamen Therapeutika. Einige Methoden wurden für die AD-Diagnostik vorgeschlagen, in welchen die Aβ-Oligomerkonzentration in Körperflüssigkeiten als Biomarker dienen, da diesen Molekülen die entscheidende Rolle in der AD-Pathogenese zugeschrieben wird. Allerdings fehlt diesen Methoden ein zuverlässiger Standard für die Assay-Kalibrierung und inter-/intra-Assay Vergleichbarkeit. Moleküle wie synthetische Aβ-Oligomere, Aβ-Dimere und multiple Antigen-Peptide (MAPs) wurden in verschiedenen Assays validiert, jedoch ohne Übereinstimmung darüber, welcher Standard den pathologisch relevanten Aβ-Oligomeren am nächsten kommt. In dieser Arbeit wurde die Verwendung von stabilisierten Aβ-Oligomeren als Standardmolekül im sFIDA-Assay (surface-based fluorescence intensity distribution analysis) gezeigt. Die Konzentration von stabilisierten Oligomeren, die in PBS, CSF und Blutplasma verdünnt wurden, korreliert mit dem sFIDA-readout in einem Konzentrationsbereich zwischen 1 fM und 100 pM. Die untere Nachweisgrenze der Oligomere in PBS, CSF und Blutplasma lag bei 32 fM, 24 fM und 22 fM. Zusätzlich wurde ein neuer Standard mit definierter Größe und bekannter Zahl an Epitopen im Rahmen dieser Arbeit entwickelt: Silika-Nanopartikel, an die kovalent Aβ gebunden ist (Aβ-SiNaP). Die Silika-Nanopartikel wurden nach dem Stöber-Prozess hergestellt und anschließend mit Aβ-Molekülen über EDC/NHS-Kopplung biofunktionalisiert. Anhand von sFIDA-Messungen wurde für Aβ-SiNaP eine Stabilität von mindestens vier Monaten nachgewiesen. Des Weiteren wurde die erste Anwendung von Aβ-SiNaP an einer Studie zur Bestimmung der Eignung von verschiedenen Gerinnungshemmern für Aβ-Detektion in Blutplasma beschrieben. Es wurde gezeigt, dass der sFIDA-readout mit der Konzentration von Aβ-SiNaP verdünnt in PBS oder EDTA-, Zitrat- und Heparin-Plasma korreliert. Anhand von Kriterien wie die Reproduzierbarkeit, die Linearität und die Sensitivität dessFIDA-Assays hat sich EDTA als Gerinnungshemmer der Wahl für die Quantifizierung von Aβ-SiNaP in Plasma herausgestellt. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder and the most common form of dementia, with 100 mio. affected people predicted for 2050. Currently, neither a certain pre mortem diagnosis nor an effective causative therapy are available. The establishment of a reliable diagnostic assay for the early diagnosis of AD is of great importance for the development of effective therapeutics. Several approaches have been proposed for AD diagnosis with oligomeric Aβ concentration in body fluids as a potential biomarker for AD. Aβ oligomers are considered to play a crucial role in the AD pathogenesis. However, these methods lack a reliable standard for assay calibration and inter-/intra-assay comparability. Molecules such as synthetic Aβ oligomers, Aβ dimers and multiple antigen peptides (MAPs) have been validated as standards in various assays, but no consensus has yet been achieved on which standard should be used for quantification of the pathologically relevant Aβ species. In this study, the application of stabilized Aβ oligomers as standard molecules in the sFIDA assay (surface-based fluorescence intensity distribution analysis) was demonstrated. A correlation between the applied concentration of stabilized oligomers, diluted in PBS, CSF or blood plasma samples and the sFIDA readout was shown for a concentration range from 1 fM to 100 pM. The lower limits of detection for stabilized oligomers in PBS, CSF and plasma were 32 fM, 24 fM and 22 fM, respectively. Additionally, a novel size-defined standard with a known number of epitopes in form of Aβ-coated silica nanoparticles (Aβ-SiNaP) was developed within the scope of this study. Silica nanoparticles were synthesized according to the Stöber process and biofunctionalized with Aβ via EDC/NHS coupling. The stability of this standard was shown by application of Aβ-SiNaP, diluted in water and CSF, in the sFIDA assay for at least four months at 4 °C . Furthermore, Aβ-SiNaP were applied in order to assess the most suitable anti-coagulant for Aβ oligomer detection in blood plasma. A correlation between Aβ-SiNaP concentration and the sFIDA readout was demonstrated for Aβ-SiNaP diluted in PBS or EDTA, citrate and heparin plasma. Based on criteria such as reproducibility, linearity and sensitivity of the sFIDA assay, EDTA proved to be the anti-coagulant of choice for quantification of Aβ-SiNaP in blood plasma.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	21.12.2016
Dateien geändert am:	21.12.2016
Promotionsantrag am:	19.01.2016
Datum der Promotion:	09.02.2016