Dokument: A modified P450 Cytochrome as Safety Mechanism in Adoptive T-cell Therapy

Titel:	A modified P450 Cytochrome as Safety Mechanism in Adoptive T-cell Therapy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37714
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160329-084901-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Röllecke, Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,21 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.03.2016 / geändert 22.03.2016
Beitragende:	PD Dr. Hanenberg, Helmut [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Adaptive T-Zelltherapien mit unveränderten allogenen oder genetisch veränderten autogenen T-Zellen kann eine Immunität gegen maligne Zellen vermitteln. Um die Sicherheit dieser zellulären Therapien zu erhöhen, ist es wichtig, die T-Zellen vor der Infusion mit einem Suizidgen auszustatten, welches somit eine spezifische Kontrolle in vivo ermöglicht. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen klinisch einsetzbaren selbstinaktivierenden (SIN) lentiviralen Vektor zur effizienten Koexpression von zwei Transgenen zu entwickeln, der für die Anwendung einer Donor-Lymphozyten-Infusion nach allogener Stammzelltransplantation oder für die spezifische Eliminierung autogener T-Zellen, die einen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, geeignet ist. Als neuartiges Suizidgen habe ich eine aktivitäts-optimierte Variante des humanen CYP4B1 Enzyms verwendet, das eine ER-membranständige Monooxygenase ist, die spezifisch das natürlich vorkommende Prodrug 4-Ipomeanol zu einer hochgiftigen alkylierenden Substanz katalysiert. Diese modifizierte CYP4B1-Variante sollte entweder mit dem trunkierten CD34 oder CD271/p75 nerve growth factor receptor als Selektionsmarker für die Donor-Lymphozyten-Infusion oder mit CARs gegen CD19, CD22 und CD33 als Immuntherapie gegen ALL und AML durch autologe T- Zellen koexprimiert werden. Hierzu wurden die Komponenten eines lentiviralen Expressionsvektor systematisch getestet. Diese umfassen sowohl verschiedene virale oder menschliche Housekeeping Promotoren, mit oder ohne aktiven Spleiß-Stellen, als auch Strategien zur Koexpression zweier Transgene durch zwei Promotoren, ein IRES Element oder einem CHYSEL wirkenden Element, der 2A-Seite. Funktionell erfolgreiche Parameter für die verschiedenen Konstrukte waren die MACS Selektion, die Induktion der Apoptose und die CAR-vermittelte Zytotoxizität gegen Leukämiezellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden systematisch unterschiedliche Struktur-Analoga von 4-Ipomenol in menschlichen Leberzellen und die Induktion von Apoptose in primären T-Zellen analysiert. Eines der Substrate ist Perilla keton, ein natürlich vorkommendes Lungentoxin. Perilla keton induziert Apoptose in MACS selektionierten humanen T-Zellen, die das modifizierte CYP4B1 exprimieren, bei gleicher Konzentration doppelt so effektiv wie 4-Ipomeanol. In dieser Arbeit wurden mehrere klinisch relevante Expressionskonstrukte entwickelt, die potentiell adaptive T-Zelltherapien bei Menschen sicherer gestalten können. Dies muss in präklinischen Tiermodellen in vivo weiter verfolgt werden. Zudem wurde ein neues wirksameres Prodrug für das CYP4B1 Suizidgen identifiziert, das durch in vivo Studien in einer Cyp4b1- Knock-out Maus für den potentiellen klinischen Gebrauch weiter getestet werden muss. Adoptive T-cell therapies with unmodified allogeneic or genetically engineered autologous T-cells can transfer immunity against malignant cells. An important safety strategy for these cellular therapies is to equip the T-cells prior to reinfusion with a suicide gene that facilitates specific in vivo control. A major focus of this thesis was to develop clinically applicable self-inactivating (SIN) lentiviral vectors with efficient coexpression of two transgenes, either for donor lymphocyte infusion after allogeneic stem cell transplantation or for eliminating autologous T-cells expressing chimeric antigen receptors (CARs). As a novel suicide gene, I used an activity-optimized human CYP4B1 enzyme that is an ER-expressed monooxygenase and specifically bio-catalyzes a natural occurring pro-drug, 4-ipomeanol, towards a highly toxic alkylating substance. Systematically testing of the best modules for co-expression of modified CYP4B1 either with truncated CD34 or CD271/p75 nerve growth factor as selection markers for donor lymphocyte infusions or with CARs targeting CD19, CD22 and CD33 for immunotherapy of ALL and AML by autologous T-cells included different viral or human housekeeping promoters with or without splice-active sites and co-expression strategies with two promoters, IRES or 2A sites, a CHYSEL-acting element. Successful functional read-outs for the different constructs were MACS selection, apoptosis induction and CAR-mediated cytotoxicity against leukemia cells. In the second part of the thesis, I systematically analyzed different structure analogues of 4-ipomenol in human liver cells and the induction of apoptosis in primary T-cells. Importantly, one of these substrates, perilla ketone, which is a naturally occurring pneumotoxin, was twice as efficient at similar concentrations as 4-ipomeanol to induce apoptosis in mutant CYP4B1 expressing genetically modified affinity selected human Tcells. In summary, I developed several clinically suitable constructs in this thesis that will potentially make adoptive T-cell therapies in humans safer and that will be further tested in preclinical animal models in vivo. In addition, I also identified a novel more potent prodrug for the CYP4B1 suicide gene that needs to be further tested in vivo in Cyp4b1-/- mice for potential clinical usage.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.03.2016
Dateien geändert am:	29.03.2016
Promotionsantrag am:	04.11.2015
Datum der Promotion:	16.12.2015