Dokument: Evaluierung zellkulturbasierter Strategien zur Optimierung von Proliferation und osteogener Transdifferenzierung humaner Fibroblasten

Titel:	Evaluierung zellkulturbasierter Strategien zur Optimierung von Proliferation und osteogener Transdifferenzierung humaner Fibroblasten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37395
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160304-125047-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Eckhardt, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 45,25 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.03.2016 / geändert 03.03.2016
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Suschek, Christoph V. [Gutachter] Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Mahotka, Czaba [Gutachter]
Stichwörter:	osteogene Transdifferenzierung; Tissue Engineering
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Um die Nutzung humaner Hautfibroblasten für medizinisch-regenerative Therapieansätze zu optimieren, sucht diese Arbeit nach Faktoren zur Beschleunigung von Proliferation und osteogener Transdifferenzierung. Diesbezügliche Effekte wurden u. a. Zytokinen, Stickstoffmonoxid (NO), Spenderalter, DNA-Methylierung, Passagierung, Transdifferenzierungsmedien, Scherstress und Inkubationsdauer zugeschrieben. Eine systematische Evaluierung dieser Faktoren bzw. deren Wirkung in bestimmten Kombinationen anhand quantifizierbarer Merkmale war bisher nicht erfolgt. Die Quantifizierung der Proliferation erfolgte mittels Neubauer-Verfahren oder Cell Viability Assay. Nach Kategorisierung nach Spenderalter und Passage konnte das Zellwachstum im Laufe von fünf Tagen verglichen werden. In einem weiteren Schritt wurden Zellen juveniler Donoren in Passage 3 (pas ≤3) und später (pas >3) zwischen dem dritten und fünften Tag mit verschiedenen Konzentrationen von Interleukin-1β, -6, -8, Interferon-γ, Transforming Growth Factor β (TGF-β), Tumor Necrosis Factor α (TNF-α), Fibroblast Growth Factor 2 (FGF-2) und NO inkubiert und gemessen. Zur Bestätigung der Transdifferenzierung wurde alkalische Phosphatase (AP) mittels AP-Assay, RunX 2 mittels Western Blot und Alizarin Rot Färbung (ARS) mittels -Rücklösung detektiert. Um eine Transdifferenzierungsreferenz zu etablieren, wurden juvenile Fibroblasten pas ≤3 über drei Wochen mit Dexamethason-Medium (u. a. 100 nM Dexamethason) inkubiert und die Umgebungsbedingungen täglich kurz verändert. Variierungen dieses Designs nach Spenderalter, Passage, DNA-Methylierung, Transdifferenzierungsmedium, Umgebungsbedingungen oder Scherstress sollten der Vergleichbarkeit von Ergebnissen der Referenz mit ihren Modifikationen dienen. Das Wachstum in der Transdifferenzierungsreferenz wurde mittels Neubauer-Verfahren gemessen, um später unter ähnlichen Bedingungen Zellen mit einzelnen Bestandteilen des Dexamethason-Mediums zu inkubieren und mittels Cell Viability Assay deren abhängige Proliferation zu quantifizieren. Die Proliferation juveniler Fibroblasten übertrifft nicht nur signifikant jene adulter Spender, auch nimmt das Wachstum für juvenile Zellen pas >3 gegenüber pas ≤3 signifikant zu. Weiterhin reduzieren TGF-β, 1000 IU/ml Interferon-γ und NO signifikant das Wachstum juveniler Zellen pas ≤3, während FGF-2 die Proliferation für pas >3 verstärkt. Eine osteogene Transdifferenzierung mit jeweils signifikanter AP-Enzymaktivität ab der ersten Woche, RunX 2-Expression eine Woche später und ARS-Quantifizierung in Woche 3 entwickelt sich in der oben beschriebenen Transdifferenzierungsreferenz. Der Vergleich der Ergebnisse der Modifikationen mit jenen der Referenz macht eine Abhängigkeit der Osteogenese von juvenilem Spenderalter, geringer Passagierung und Verwendung von Dexamethason-Medium deutlich. Im Hinblick auf die Interaktion zwischen Proliferation und osteogener Transdifferenzierung zeigt sich eine signifikante Stimulation des Wachstums ausschließlich durch das gesamte Dexamethason-Medium für juvenile Fibroblasten; auch hier mit signifikantem Unterschied zu Gunsten von pas >3 gegenüber pas ≤3. Somit zeigt diese Arbeit die prinzipielle Potenz humaner Fibroblasten zur osteogenen Transdifferenzierung und damit zur möglichen klinischen Anwendung. Eine Darstellung der Transdifferenzierung als quantifizierbaren, stufenweisen Prozess mittels sequentiellen Nachweisen von AP, RunX 2 bzw. ARS, kann als Ausgangspunkt für weitere Ansätze zur Optimierung dienen. Entgegen bisherigen Erkenntnissen beeinflussen Spenderalter, Seneszenz und Medium sowohl Proliferation als auch Transdifferenzierung erheblich und determinieren damit das Potenzial einer Nutzung dieser Zellart im Rahmen medizinisch-regenerativer Therapieansätze.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	2011-2016
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	04.03.2016
Dateien geändert am:	04.03.2016
Promotionsantrag am:	27.01.2015
Datum der Promotion:	19.01.2016