Dokument: Human Liver ABC-Transporters – Recombinant Expression and Interactome Studies

Titel:	Human Liver ABC-Transporters – Recombinant Expression and Interactome Studies
Weiterer Titel:	Humane Leber ABC-Transporter – Rekombinante Expression und Interaktom Studien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37386
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160307-101446-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Przybylla, Susanne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,65 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.03.2016 / geändert 02.03.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Keitel-Anselmino, Verena [Gutachter]
Stichwörter:	BSEP, ABCG2, Membrane Yeast Two-Hybrid, Protein-Protein-Interaktion
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	ATP-binding cassette (ABC)-transporters are indispensable for the secretion functions of the human liver. Particularly the ABC-transporters of the apical or canalicular membrane of hepatocytes are involved in essential processes such as detoxification and the secretion of bile. The multidrug transporter ABCG2 and the bile salt export pump (BSEP/ABCB11) are in the focus of this thesis. The former participates in the multidrug resistance of cancer cells against chemotherapeutics and the pathogenesis of conditions like gout, while BSEP is the driving force of the enterohepatic circulation of bile salts. Dysfunction of BSEP leads to cholestasis, which causes a number of complications from malabsorption of lipids and fat-soluble vitamins up to liver failure. Despite various in vivo studies on these transporters, many aspects, especially molecular mechanisms and their effects on pathogenesis, are not satisfactorily understood. The present thesis addresses the production of recombinant, purified transporters for in vitro investigation particularly in relation to regulative protein-protein interaction. For ABCG2, expression was established in the fast growing and inexpensive model organism E: coli. In the following, the multidrug transporter was purified to more than 85 % homogeneity. Correct folding of the transporter was assessed by its ATPase activity in detergent solution, which was achieved by the addition of the cholesterol analogue cholesteryl hemisuccinate. This established a simple and fast procedure to obtain active ABCG2 for molecular investigation of the transporter such as structure determination. A previously established overexpression protocol for BSEP in the yeast Pichia pastoris was optimized. The purified transporter was used in interaction studies with possible regulatory and stabilizing proteins. Additionally, liver proteins derived from a cDNA library were screened for interaction with BSEP in a yeast two-hybrid approach. A number of ER proteins with functions in topogenesis, quality control and intracellular trafficking were identified. Furthermore, two enzymes involved in bile salt synthesis and the membrane-cortex cross-linking protein radixin were found to interact with BSEP. In addition to the few previously known interaction partners during canalicular protein cycling, these proteins outline a path of interactions for BSEP from synthesis to the plasma membrane. The eleven identified interaction partners form the basis for further investigations of BSEP trafficking defects, which are a major cause for BSEP-associated cholestasis. ABC (‚ATP binding cassette’)-Transporter nehmen bei den Sekretionsfunktionen der menschlichen Leber eine zentrale Rolle ein. Insbesondere die ABC-Transporter der apikalen oder kanalikulären Membran der Hepatozyten sind unabdingbar für Prozesse wie die Entgiftung und Bildung der Gallenflüssigkeit. Im Fokus dieser Arbeit stehen der Multidrogen Transporter ABCG2 und die Gallensalz Exportpumpe (BSEP/ABCB11). Ersterer ist sowohl an der Multiresistenz von Krebszellen gegenüber Chemotherapeutika als auch an der Pathogenese von Krankheiten wie Gicht beteiligt. BSEP ist die treibende Kraft für die enterohepatische Zirkulation von Gallensalzen und Fehlfunktion des Transporters führen zu Cholestase, deren Folgen von Maldigestion insbesondere von Fetten und fettlöslichen Vitaminen bis zu Leberversagen reichen. Trotz weitreichender Untersuchung der Transporter in lebenden Systemen, sind insbesondere die molekularen Mechanismen, welche ein umfassendes Verständnis der ABC-Transporter und der mit ihnen zusammenhängenden Krankheiten ermöglichen, noch nicht ausreichend verstanden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung und Optimierung von Methoden zur rekombinanten Expression und Reinigung von Transportern für deren in vitro Untersuchung. Hier lag der besondere Fokus auf der Aufklärung von regulativen Protein-Protein Interaktionen. Für den Drogentransporter ABCG2 wurde die Expression in dem schnell wachsenden und günstigen Modellorganismus E. coli etabliert. Der Transporter konnte im Folgenden in einem Schritt auf über 85 % Homogenität gereinigt werden. Die korrekte Faltung von ABCG2 in Detergenzlösung konnte über die ATPase Aktivität nachgewiesen werden, die durch das Cholesterin-Analog Cholesterylhemisuccinat erreicht wurde. Somit ist nun ein einfaches und schnelles System vorhanden, um aktives ABCG2 für molekulare Untersuchungen, wie zum Beispiel die Strukturaufklärung zu erhalten. Für BSEP wurde ein bereits etabliertes Expressionsprotokoll in Pichia pastoris optimiert und der gereinigte Transporter in Untersuchungen zu seiner Interaktion mit möglichen regulatorischen und stabilisierenden Proteinen eingesetzt. Zusätzlich wurden Leberproteine ausgehend von einer cDNA Bibliothek mit einem Hefe-Zwei-Hybrid System auf Interaktionspartner von BSEP untersucht. Es wurden eine Reihe von ER Proteinen mit Funktionen bei der Proteintopogenese, Qualitätskontrolle und im intrazellulären Proteintransport identifiziert. Außerdem wurden zwei Enzyme, die an der Synthese von Gallensalzen beteiligt sind, sowie Radixin, ein Verbindungsprotein von Membran und Zytoskelett, gefunden. Die Identifikation dieser Proteine zeichnet, zusätzlich zu den wenigen, bereits bekannten Interaktionspartnern beim kanalikulären Austausch, den Weg von BSEP von der Synthese bis zur Plasmamembran nach. Es konnten elf bisher unbekannte Interaktionspartner identifiziert werden, welche die Grundlage für weitere Untersuchungen in Bezug auf fehlerhaften Proteintransport bilden, welcher eine häufige Ursache von BSEP assoziierter Cholestase ist.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	07.03.2016
Dateien geändert am:	07.03.2016
Promotionsantrag am:	11.01.2016
Datum der Promotion:	18.02.2016