Dokument: Yeasts as Production Hosts for Biocatalysts

Titel:	Yeasts as Production Hosts for Biocatalysts
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37372
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160301-094003-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Morka, Kamila [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,59 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.03.2016 / geändert 01.03.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Enzyme als natürliche Katalysatoren finden in der organischen Chemie mehr und mehr Anwendungen vor allem aufgrund ihrer Selektivität. Darüber hinaus wurde es durch Fortschritte in der Proteintechnologie möglich, wesentliche Enzymeigenschaften zu beeinflussen. Effiziente Expression des Enzyms in einem heterologen Wirt ist eine Grundvoraussetzung zur erfolgreichen Anwendung in der Biokatalyse. In dieser Arbeit wurden die eukaryotischen Hefeexpressionssysteme Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis und Hansenula polymorpha verglichen und nicht nur die Produktivität, sondern auch die Eigenschaften des hergestellten Enzyms analysiert, um den möglichen Einfluss der Wirts-spezifischen Änderungen zu untersuchen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Eignung der Hefen zur effizienten Produktion einer weniger bekannten Familie der Glycosylhydrolasen, Rhamnosidasen, untersucht, um die potentielle Anwendbarkeit dieser Enzyme für die Biokatalyse zu erhöhen. Als erstes Modellenzym wurde die bekannte Lipase A aus Candida antarctica (CALA) ausgewählt und erstmalig die Codonverwendung desselben Gens zur parallen Expression in drei Organismen optimiert. Alle Hefen waren in der Lage aktive CAL-A zu produzieren, jedoch mit signifikanten Unterschieden in der Ausbeute: H. polymorpha zeigte eine zehnfache Steigerung der Produktivität im Vergleich zu S. cerevisiae. Auch die Untersuchungen zur thermischen Stabilität und Aktivität der gereinigten Enzyme gegenüber verschiedenen Substraten ergaben eine signifikante Wirkung des Wirts auf die biochemischen Eigenschaften des hergestellten Proteins. So behielt die CAL-A aus K. lactis 70% ihrer Aktivität nach Inkubation bei 60 °C im Vergleich zu 45% Restaktivität aus S. cerevisiae und bei Tests mit verschiedenen Substraten wurde eine Vervierfachung der Aktivität zwischen den Enzymen aus H. polymorpha und S. cerevisiae gefunden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse beispielhaft, dass die Auswahl des Expressionswirts selbst innerhalb einer taxonomischen Familie (Saccharomycetaceae) die Eigenschaften des produzierten Enzyms erheblich beeinflusst und zukünftig mehr Beachtung verdient. Als weniger bekannte Enzymfamilie wurden die Rhamnosidasen der GH Familie 78 ausgewählt, um ihre mögliche Anwendung in der chemischen Synthese zu untersuchen. Dazu wurden drei veröffentlichte Rhamnosidasen verwendet: RhaBa aus Bacillus sp., RhaLa aus Lactobacillus acidophilus und RhaHp aus Hansenula polymorpha. Auch mit den drei eukaryotischen Testwirten konnte keine der getesteten Rhamnosidasen in aktiver Form sekretiert werden. Die Rhamnosidase RhaBa wurde allerdings erfolgreich in E. coli hergestellt und daher für Mutageneseversuche zu einer Glycosynthase angewendet. Die erzeugten Varianten wurden mit verschiedenen Donoren und Akzeptoren getestet und obwohl das gewünschte Produkt nicht entdeckt werden konnte, können einige wertvolle Beobachtungen aus diesen Versuchen entnommen werden. Als Vorteile zur industriellen Anwendung zeigten sich neben der guten Herstellung mit E. coli auch eine lange Lagerbarkeit des Lyophilisates sowie die geringe Wirkung von bis zu 20% DMSO auf die Enzymaktivität. Das Enzym scheint selektiv für Rhamnose als Glycosylgruppe zu sein, da das Standardsubstrat pNP-α-Rhamnopyranosid mit hoher Spezifität hydrolysiert und pNP- β-D-Glucopyranosid nicht als Substrat akzeptiert wurde. Es ist möglich, dass RhaBa nicht in eine Glycosynthase modifiziert werden kann, wie bereits für andere Enzyme berichtet wurde, allerdings wären zunächst weitere Versuche mit stabileren Glycosylgruppe- Donoren, z.B. Aziden, zu empfehlen. Bei der Rhamnosidase RhaHp wurde das bisher unbekannte Gen erfolgreich identifiziert und aktives intrazelluläres Protein homolog mit H. polymorpha produziert. Das Kristallisationsscreening führte zur Bildung von mehreren kleinen plattenförmigen Kristallen, deren anisotrope Diffraktion leider nicht ausreichte zur Klärung einer weiteren der nahezu noch unveröffentlichten Rhamnosidasestrukturen aber dennoch Hoffnung macht. Enzymes, as natural catalysts, are becoming more widely applied in organic chemistry due to their selectivity and availability. High yield expression of a desired enzyme in a heterologous host is a prerequisite for its successful application in biocatalysis. Yeasts are an especially attractive expression platform, as they combine many advantages of producing proteins in microbes with the eukaryotic ability to modify and secrete the produced protein. In this thesis, two main topics were addressed. Firstly, possible influence of host-specific changes on the properties of the produced protein was investigated. For this purpose, three industrially relevant yeast strains: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis and Hansenula polymorpha were selected. Comparative expression of the model enzyme in the yeasts revealed significant difference in the biochemical properties of the produced protein. The results exemplify how the selection of the host even within one taxonomic family (Saccharomycetaceae) affects the produced enzyme’s characteristics. The second part of this thesis focused on the application of the yeast expression systems for expression and modification of rhamnosidases as a prerequisite for their potential application in the synthesis of glycoside containing natural products. Three published rhamnosidases – RhaBa from Bacillus sp, RhaLa from Lactobacillus acidophilus and RhaHp from H. polymorpha – were targeted during this study and four major aspects: gene identification, expression, creation of mutants with altered activity and crystallisation were investigated. The protocols for protein expression, purification and crystallisation established in this study, as well as created rhamnosidase variants are important step towards future application of this enzyme class in biocatalysis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	01.03.2016
Dateien geändert am:	01.03.2016
Promotionsantrag am:	07.01.2015
Datum der Promotion:	04.05.2015