Dokument: Funktionale Charakterisierung des macrophage capping protein (CapG) und dessen Nachweis auf zirkulierenden Tumorzellen des Mammakarzinoms
| Titel: | Funktionale Charakterisierung des macrophage capping protein (CapG) und dessen Nachweis auf zirkulierenden Tumorzellen des Mammakarzinoms | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37277 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160411-101311-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Neumann, Martin H. D. [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. rer. nat. Neubauer, Hans [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. rer. nat. Martin, William [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | CapG, zirkulierende Tumorzellen, CTC, CTCs, CellCelector, Mikromanipulation, Isolation einzelner Zellen | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Eine erhöhte Expression des Actin-regulierenden macrophage capping proteins (CapG)
ist an der Tumorinvasivität beteiligt, jedoch sind die Mechanismen unklar. Vorarbeiten bestätigten die Korrelation zwischen CapG und Invasivität in Zelllinien. Hier konnte diese Invasivität ebenfalls auf Tumorproben des Mammakarzinoms gezeigt werden. Bisher ist nur die Ca2+-abhängige Regulation der Cytoskelettkomponente Actin von CapG näher charakterisiert und demnach ist CapG im Cytoplasma lokalisiert. Allerdings ist CapG auch im Zellkern nachweisbar, wobei die Funktion, welche CapG im Zellkern ausübt, nicht bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es, CapG im Hinblick auf dessen Induktion der Invasivität funktional zu charakterisieren und die Subpopulation von Tumorzellen (zirkulierende Tumorzellen, CTCs), die ein hohes Potential an Invasivität besitzen, auf die CapG-Expression hin zu untersuchen. Es wurde anhand von Tumormaterial CapG als Tumorinvasionsmarker bestätigt. Hier wiesen 28% (n=78) der Tumorproben eine hohe Expression auf, wobei dies mit dem M1-Status und ERneg-Status signifikant korrelierte (p<0,05). Eine ROC-Analyse wies CapG, bezogen auf den M1-Status, mit einer Vorhersagekraft von 40% als tendenziellen Klassifikator aus. Aufgrund der Kern-Lokalisation von CapG wurden in Vorarbeiten, mit einem bereits etablierten Zellkulturmodell (MDAMB 231 und BT-20), Microarrays durchgeführt. Eine erneute bioinformatische Analyse und der direkte Vergleich mit dem Expressionsprofil aus Tumorgewebe ergab eine Korrelation der Gen-Expression von gpnmb, nrp1, loxl2, trim46, col16a1 ( Überexpression zusammen mit CapG) und zdhhc11 sowie kiaa1467 (verminderte Expression bei CapG- Überexpression) mit CapG. Das zur Zeit in einer klinischen Phase (Stufe II) in Testung gegen ossäre Metastasen (Mammakarzinom) befindliche GPNMB-Protein konnte in Validierungsexperimenten als CapG-abhängig reguliertes Protein bestätigt werden. GO-Analysen der Microarrays wiesen auch auf eine Beteiligung von CapG bei Termini der extrazellulären Matrix, Zelladhäsion und Ossifikation hin. Weiterhin erfolgte eine Co-Immunpräzipitation mit nachgeschalteter Massenspektrometrie um über das CapGInteraktom die Mechanismen des CapG Einflusses auf die Transkription aufzuklären. Es konnten 154 potentielle Interaktionspartner identifiziert werden, welche im Vergleich zu einer Interaktom-Studie aus der Literatur in 36 potentielle Interaktionspartner spezifiziert werden konnte. Eine Analyse über funktionale Annotation der Proteine ergab, dass die Interaktionspartner an der Actin-Regulation, der mRNA-Prozessierung, mRNA-Splicing, Protein-DNA-Komplexierung, DNA-Packaging und der Regulation der Apoptose beteiligt sind. Zum Nachweis von CapG auf CTCs konnte für die notwendige Isolation von CTCs eine automatisierte Mikromanipulationsanwendung (CellCelector) etabliert werden. CTCs wurden wie folgt klassifiziert: DAPIpos, Cytokeratinpos und CD45neg. Die optimierten Isolationsparameter, wie Aspirationsvolumen sowie -höhe des CellCelectors wurden bestimmt. Nach CellSearch Analyse wurden 97% der SKBR3 Zellen und 95% der CTCs nach CellCelector-Scan detektiert. Es wurden 87% der von CellSearch klassifizierten CTCs detektiert und isoliert. Eine Regressionsanalyse des Wiederfindungsund Isolationserfolges von CTCs aus Patientenproben (n=20) im Vergleich zum CellSearch- System ergab R2=0,98. CTCs wurden auf Haftobjektträger abgelegt und für CapG gefärbt, quantifiziert, anschließend erneut isoliert und in PCR-Tubes transferiert. Es konnte ein CapG-Score (von 0 bis 3) auf den CTCs etabliert werden, demnach sind von 59 analysierten CTCs 40% schwach CapG positiv (Score 1+), 37% stark CapG positiv (Score 2+), 15% wiesen einen sehr starken CapG-Gehalt auf (Score 3+). Es wurde nach Mikromanipulation die Sequenzierung von CTCs nach Whole Genome Amplification (WGA) demonstriert. In einer Patientin mit 5 CTCs wurde eine PIK3CAMutation nachgewiesen (G->A, E545K). CapG ist involviert in diverse f¨ur die Metastasierung relevante Signalwege und Prozesse. CapG kann somit als Invasions- und Tumormarker auch für CTCs Verwendung finden und ist möglicherweise ein Prädiktor für die Metastasierung.Increased expression of macrophage capping protein (CapG) is involved in tumor invasion. However, the mechanisms are unclear. Previous work verified that increased CapG expression correlates with increased invasion potential in cell lines. Here induced invasion potential after CapG over expression was also shown in breast cancer samples. Ca2+-dependent regulation of actin is the only characterized action of CapG performing its function in the cytoplasm. However, CapG is also located in the nucleus, but the functionality is not clear. Aim of this work was to characterize CapG in regard of its potential to induce invasion as well as to verify CapG protein expression on circulating tumor cells (CTCs), because of their high potential for migration and invasion. CapG expression was determined on 78 breast cancer samples showing in 28% a high CapG expression and it correlates significantly with M1 status as well as ERneg status (p<0,05). CapG was tested to be a classifier for M1 using a ROC analysis (right-positiv-rate of 40%). Due to the fact of CapG presence in the nucleus microarrays were performed previously. Bioinformatic analysis compared directly with a sample subset from tumor tissue revealed 81 differential expressed genes: gpnmb, nrp1, loxl2, trim46, col16a1 (co-regulated with CapG) and zdhhc11 as well as kiaa1467 (contrary expressed to CapG). GPNMB, currently novel target in a clincal trail (phase II) against bone marrow metastasis (breast cancer), was validated to be CapG-dependent expressed. GO analysis of the microarray results revealed CapG-dependend regulated genes playing roles in extra cellular matrix, cell adhesion or ossification. Moreover, analysis of the CapG interactome via co-immunoprecipitation and massspectrometry revealed a list of 154 potential interaction candidates and 36 of them are also listed as novel interaction partners elsewhere. Annotation analysis of these proteins showed, that they are taking part in actin regulation, mRNA processing, mRNA splicing, protein-DNA complexation, DNA packaging and regulation of apoptosis. To verify CapG expression in CTCs the automated micromanipulation technology (Cell- Celector) was established. CTCs are classified as DAPIpos, Cytokeratinpos and CD45neg cells. The optimized isolation parameters using the CellCelector were determined After Cell- Search analysis 97% of spiked SKBR3 cells and 95% of patient CTCs were detected by rescanning using the CellCelector system. A regression analysis of recovery and isolation success using patient samples (n=20) revealed: R2=0,98. After transfer of the content out of the CellSearch cartridge to chamber slides on a magnet adapter 87% of CellSearch classified CTCs could be detected and isolated using the CellCelector following transfer to glass slides. Here they were stained for CapG and the staining was quantified using an established scoring system (CapG scoring from 0 to 3+). In total CapG protein expression was quantified on 59 CTCs. CapGpos-CTCs showed in 40% weak CapG signal (score 1+), 37% showed a strong CapG signal (score 2+) and 15% showed a very strong signal (score 3+). Sequencing after micromanipulation of CTCs were demonstrated. Next, CTCs were processed for Whole Genome Amplification (WGA). Quality of WGA products was checked by the Ampli1 - QC protocol and genomic analyses (Panel-Sequencing) were performed successfully. One patient with 5 CTCs showed PIK3CA-mutation (G->A, E545K) CapG is involved in various signalling pathways and processes necessary for successful metastatic spreading. CapG is a potent invasion and tumor marker and could serve as a predictor of potential to metastasis. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.04.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.04.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.09.2015 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.02.2016 |
