Dokument: NMR-spektroskopische Charakterisierung der Dynamik des Autophagie-relevanten Proteins GABARAP auf verschiedenen Zeitskalen

Titel:	NMR-spektroskopische Charakterisierung der Dynamik des Autophagie-relevanten Proteins GABARAP auf verschiedenen Zeitskalen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37146
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160215-105953-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Möller, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.02.2016 / geändert 10.02.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik
Beschreibung:	Das 117 Aminosäuren umfassende GABAA-Rezeptor-assoziierte Protein (GABARAP) aus H. sapiens ist ein Schlüsselprotein in der Autophagie. Im letzten Jahrzehnt wurde eine Vielzahl von Interaktionspartnern identifiziert, welche die Relevanz von GABARAP für Vesikeltransport und Membranfusionen in der Autophagie und Apoptose verdeutlichen. Die enzymatische Lipidierung von GABARAP ermöglicht eine Verankerung an Membranen, um so Hemifusion von Membranen durch eine Oligomerisierung von GABARAP zu vermitteln. Die Strukturbestimmung von GABARAP durch NMR und Röntgenkristallographie weist auf signifikante Konformationsänderungen hin, welche in der gesamten GABARAP/MAP1LC3/Atg8 Familie konserviert sind. Interessanterweise hat die Kristallisation unter Hochsalzbedingungen zu einer offenen, oligomeren Konformation von GABARAP geführt, in der die N-terminale Region mit der hydrophoben Bindetasche des benachbarten GABARAP-Moleküls assoziiert. Es bleibt unklar, ob diese Konformation durch die Oligomerisierung tatsächlich Membranfusionen begünstigt oder ob es sich um einen Kristallisationsartefakt handelt. Strukturelle Details, die Kinetik und Thermodynamik, sowie die funktionelle Relevanz der Konformationsänderungen von GABARAP sind bisher nur wenig verstanden. In dieser Arbeit ist die Dynamik von GABARAP durch NMR-Spektroskopie charakterisiert worden, da diese Methode die Aufklärung von Struktur und Dynamik auf allen relevanten Zeitskalen mit atomarer Auflösung ermöglicht. Insbesondere Dynamik auf der sub-Nanosekundenzeitskala beeinflusst Spinrelaxationsraten, wohingegen Dynamik auf der Mikro- bis Millisekundenzeitskala Linienverbreiterung verursacht, die durch eine Analyse der Linienform oder Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Relaxationsdispersion (RD) quantifiziert werden kann. Die Spinrelaxationsexperimente ergeben kleine Ordnungsparameter von Aminosäureresten in den Termini und in Schleifen, die auf eine erhöhte Flexibilität auf der Piko- bis Nanosekundenzeitskala hindeuten. Des Weiteren liefern die Spinrelaxationsexperimente Informationen über die Hydrodynamik und zeigen, dass GABARAP unter den gegebenen Bedingungen überwiegend monomer vorliegt, was durch Translationsdiffusionsexperimente bestätigt wurde. CPMG-RD-Experimente offenbaren zwei chemische Austauschprozesse auf der Millisekundenzeitskala. Resonanzen in der N-terminalen helikalen Subdomäne, der benachbarten Schleife, sowie Teile von β1 und β2 zeigen eine Aufspaltung von Resonanzen, verursacht durch einen Austausch von zwei nahezu gleichbesetzten Zuständen auf der Zeitskala einiger Millisekunden. Im Gegensatz dazu weisen Aminosäurereste der hydrophoben Bindetasche hp2 einen schnelleren Austauschprozess mit einer Population des angeregten Zustands von nur etwa 1 % auf. Der N-terminale Austauschprozess wurde zusätzlich durch ZZ-Austauschexperimente quantifiziert, was durch die eindeutige Auflösung von Resonanzen beider austauschenden Zustände bei niedrigen Temperaturen möglich war. In der offenen Konformation von GABARAP, die unter Hochsalzbedingungen kristallisiert wurde, fehlt die Salzbrücke zwischen Lys6 und Glu100, welche die N-terminale helikale Subdomäne und die Ubiquitin-artige Subdomäne verknüpft. Daher wurde durch Mutation eine GABARAP-Variante erstellt, in der diese Salzbrücke nicht ausgebildet wird. Die NMR-Spektren dieser Variante weisen auf signifikante Änderungen des N-terminalen Austauschprozesses hin. Aufgrund der enzymatischen Lipidierung von GABARAP und der damit verbundenen Membranverankerung wurde Nanodisk-verankertes GABARAP hergestellt und mittels TROSY sowie TROSY-CPMG-RD charakterisiert. Die erstmals an Nanodisks durchgeführten TROSY-CPMG-RD-Experimente weisen auf die Austauschprozesse von GABARAP auch in Anwesenheit von Membranmimetika hin. Fluoreszenzspektroskopie, die im Rahmen einer Kooperation erfolgte, offenbart zusätzliche Dynamik auf der Mikrosekundenzeitskala, die mit großen strukturellen Änderungen der N-terminalen helikalen Subdomäne von GABARAP einhergeht. Die Tatsache, dass GABARAP auf praktisch allen Zeitskalen dynamisch ist, verdeutlicht die Relevanz der Charakterisierung konformationeller Änderungen für das Ziel ein tieferes Verständnis von GABARAP in der Autophagie zu erlangen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	15.02.2016
Dateien geändert am:	15.02.2016
Promotionsantrag am:	07.12.2015
Datum der Promotion:	19.01.2016