Dokument: Cytochrom-P450-Biokatalyse: Selektive Oxidation von 14-gliedrigen Makrozyklen und Diterpenoiden

Titel:	Cytochrom-P450-Biokatalyse: Selektive Oxidation von 14-gliedrigen Makrozyklen und Diterpenoiden
Weiterer Titel:	Cytochrome P450 biocatalysis: selective oxidation of 14-membered macrocycles and diterpenoids
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37015
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160203-102142-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Le-Huu, Priska [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,02 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.01.2016 / geändert 28.01.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Cytochrom, P450, Monooxygenase, P450 BM3, CYP102A1, Bacillus megaterium, Cembrendiol, Cembranoide, Makrozyklen, Diterpenoide, Chemoselektivität, Regioselektivität, Stereoselektivität, Kaskade, allylische Hydroxylierung, Protein engineering, Biokatalyse, Oxidation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Cembranoide bilden eine diverse Naturstoffklasse der Diterpenoide, deren Vertreter hauptsächlich aus marinen Invertebraten und Pflanzen isoliert wurden. Sie weisen unterschiedliche biologische Aktivitäten auf, die u.a. für pharmazeutische Anwendungen interessant sind. Strukturell bestehen Cembranoide aus einem 14-gliedrigen zyklischen Kohlenwasserstoffgerüst und zusätzlichen Sauerstoff enthaltenden Gruppen. In der Biosynthese von Cembranoiden wird zunächst ein terpenoides Gerüst erstellt, in das anschließend mit Hilfe von Cytochrom-P450-Monooxygenasen Sauerstoff¬funktionalitäten eingeführt werden. Auch in der organischen Synthese sind Oxyfunktionalisierungen in späten Synthesestufen als ein effizientes Konzept beschrieben worden, um hohe Diversitäten chemischer Verbindung zu generieren. Die Herausforderung dieser späten Funktionalisierung stellt dabei die geforderte hohe Chemo-, Regio- und Stereoselektivität dar. In der vorliegenden Arbeit sollte das biokatalytische Potential der Cytochrom-P450-Monooxygenase P450-BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium für die späte Oxyfunktionalisierung verschiedener Cembranoide und Cembranoid-ähnlicher Substrate untersucht werden. Um den Effekt der Struktur des Substrates auf die enzymatische Aktivität und Selektivität zu untersuchen, wurde eine Reihe aus neun verschiedenen 14-gliedrigen Makrozyklen hinsichtlich einer P450-BM3-katalysierten Oxidation getestet. Es wurden sowohl synthetische Verbindungen als auch Naturstoffe analysiert, die jeweils eine unterschiedliche Polarität und eine unterschiedliche Anzahl an Doppelbindungen aufweisen. Unter Verwendung der P450-BM3-Mutante F87G konnte mit allen Makrozyklen eine Oxidation nachgewiesen werden. Je nach Substrat wurden fünf bis über sechzehn verschiedene Produkte detektiert, die jeweils ein bis vier neu eingeführte Sauerstoffatome besaßen. Von zwei der untersuchten Makrozyklen konnte in weiterführenden Studien die Chemo-, Regio- und Stereoselektivität der Reaktion über semirationales Proteindesign verbessert und die Anzahl der Produkte auf ein bis drei reduziert werden. Nach Oxidationen im präparativen Maßstab konnten die Produkte in isolierten Ausbeuten von bis zu 57 % erhalten werden und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Um eine chemo- und regioselektive Oxidation cembranoider oder Cembranoid-ähnlicher Verbindungen zu erreichen wurde eine Kollektion aus P450-BM3-Varianten generiert, die Aminosäuresubstitutionen an verschiedenen Positionen nahe des katalytischen Hämzentrums enthielten. Die P450-BM3-Varianten wurden hinsichtlich einer selektiven Oxidation des 14 gliedrigen Makrozyklus (3E,7E,11E)-9-Hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-trien-1,1-dimethansäuredimethylester und des Cembranoids β-Cembrendiol getestet. Beide Makrozyklen enthalten als kaum funktionalisierte diterpenoide Gerüste zahlreiche chemisch äquivalente Oxidations¬positionen. Für (3E,7E,11E)-9-Hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-trien-1,1-dimethansäuredimethylester konnte die P450-BM3-Mutante V78G/F87A identifiziert werden, die unter dreizehn möglichen Oxidationspositionen das Diterpenoid an der Position C-5 mit einer Chemo- und Regioselektivität von 90 % hydroxylierte. Für β-Cembrendiol, das neben drei potentiellen Epoxidierungs¬positionen sieben potentielle allylische und sechs nicht-allylische Hydroxylierungspositionen besitzt, wurden P450-BM3-Mutanten zur selektiven Hydroxylierung der benachbarten allylischen Positionen C-9 und C-10 oder zur Epoxidierung der C-7/C-8-Doppelbindung gefunden. Die P450-BM3-Mutante F87A/I263L wies eine 100 %ige Regioselektivität für C 9 auf und produzierte die epimeren 9-OH-β-Cembrentriole in einem Diastereomeren¬verhältnis von 89:11. Eine 97 %ige Regioselektivität für C-10 konnte mit der P450-BM3-Mutante L75A/V78A/F87G erzielt werden, die die epimeren 10-OH-β-Cembrentriole sowie das korrespondierende Enon herstellte. Die 10-OH-β-Cembrentriole wurden bestenfalls in einem Diastereomerenverhältnis von 74:26 gebildet. Mit der P450-BM3-Mutante V78A/F87A konnte das (7S,8S)-Epoxy-β-cembrendiol mit exzellenter Diastereoselektivität (dr > 99:1) produziert werden. Weiterhin konnte eine sequentielle P450-P450-Kaskadenreaktion für die zweifache Hydroxylierung des β Cembrendiols an den Positionen C-9 und C-10 als Eintopfprozess etabliert werden. Um einen geeigneten Biokatalysator für den zweiten Schritt zu finden, wurde eine Kollektion an P450-BM3-Mutanten durchmustert. Dabei konnten Mutanten identifiziert werden, die das 9 OH-β Cembrentriol an Position C-10 hydroxylieren. Während die P450-BM3-Mutante V78A/F87G die 9,10-OH-β-Cembrentetraole in einem Diastereomerenverhältnis von 50:50 herstellte, konnte mit der Dreifachmutante L75A/V78A/F87G das Diastereomerenverhältnis optimiert werden (11:89). Cembranoids represent a diverse class of diterpene natural products, whose members are mainly found in marine invertebrates and plants. They show diverse biological activities that are of interest for pharmaceutical applications. Cembranoids consist of a 14-membered hydrocarbon cycle with additional oxygen-bearing groups. The biosynthesis of cembranoids begins with the formation of a terpene cycle and proceeds with the insertion of oxyfunctionalities catalyzed by cytochrome P450 monooxygenases. Such late-stage oxidations have also been described as an efficient concept in organic synthesis for diversifying chemical substances. High chemo-, regio-, and stereoselectivity remain the main challenge of late-stage oxidations. In this thesis, the biocatalytic potential of the monooxygenase P450 BM3 (CYP102A1) from Bacillus megaterium for late-stage oxidations of cembranoids and cembranoid-like substances was demonstrated. To investigate effects of the substrate structure on enzyme activity and selectivity, a substrate series of nine different 14-membered macrocycles was tested for a P450 BM3 catalyzed oxidation. Synthetic compounds as well as natural products with varying polarity and a different number of double bonds were analyzed. Using the P450 BM3 mutant F87G, oxidations of all tested macrocycles were observed. Depending on the substrate, five to more than sixteen products each with one to four inserted oxygen atoms were detected. Further protein engineering enabled an optimization of the enzyme’s chemo-, regio-, and stereoselectivity and thereby a decrease in the number of products for two 14-membered macrocycles. After preparative scale oxidations the products were isolated with a yield of up to 57%, allowing structure elucidation by NMR spectroscopy. To achieve chemo- and regioselective oxidation of cembranoids or cembranoid-like substances, a collection of P450 BM3 mutants with amino acid substitutions at different positions close to the catalytic heme center was constructed. P450 BM3 mutants were tested for selective oxidation of the 14-membered macrocycle (3E,7E,11E)-dimethyl-9-hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-triene-1,1-dicarboxylate and the cembranoid β-cembrenediol. Both diterpene scaffolds are rarely functionalized and hence contain numerous chemically equivalent oxidation positions. Although the diterpenoid (3E,7E,11E)-dimethyl-9-hydroxy-4,8-dimethylcyclotetradeca-3,7,11-triene-1,1-dicarboxylate features thirteen possible oxidation positions, the P450 BM3 mutant V78G/F87A was identified to hydroxylate the diterpenoid preferably at position C-5 with a chemo- and regio¬selectivity of 90%. β-Cembrenediol features three potential epoxidation sites as well as seven potential allylic and six non-allylic hydroxylation sites. Nevertheless, several mutants could be identified, which selectively hydroxylated the neighbouring allylic positions C-9 and C-10 or epoxidized the C-7/C-8 double bond. P450 BM3 mutant F87A/I263L was 100% regioselective for C-9 and produced the epimeric 9-OH-β-cembrenetriols in a diastereomeric ratio of 89:11. P450 BM3 mutant L75A/V78A/F87G was 97% regioselective for C-10 and produced the epimeric 10 OH-β-cembrenetriols in a diastereomeric ratio of 74:26 next to the corresponding enone. P450 BM3 mutant V78A/F87A produced the (7S,8S)-epoxy-β-cembrenediol with excellent diastereoselectivity (dr > 99:1). Finally, a sequential P450-P450 cascade reaction for the two-step hydroxylation of β cembrenediol at positions C-9 and C-10 was established as a one-pot process. To find a biocatalyst for the second step, a selection of P450 BM3 mutants was screened for the selective hydroxylation of 9-OH-β-cembrenetriol at position C-10. Whereas P450 BM3 mutant V78A/F87G produced the 9,10-OH-β-cembrenetetraols in a diastereomeric ratio of 50:50, P450 BM3 mutant L75A/V78A/F87G showed an optimized diastereomeric ratio of 11:89.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	03.02.2016
Dateien geändert am:	03.02.2016
Promotionsantrag am:	12.10.2015
Datum der Promotion:	06.01.2016