Dokument: Partikelinduzierte Zellmigration in vitro: Etablierung und Validierung eines Screening-Tests zur Beurteilung des inflammatorischen Potenzials von Partikeln

Titel:	Partikelinduzierte Zellmigration in vitro: Etablierung und Validierung eines Screening-Tests zur Beurteilung des inflammatorischen Potenzials von Partikeln
Weiterer Titel:	Particle-induced cell migration in vitro: Establishing and validation of a screening tool for inflammatory particle effects.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36974
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160127-114427-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schremmer, Isabell [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.01.2016 / geändert 25.01.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Bünger, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Proksch Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ein sehr großer Teil der Erkrankungen und Todesfälle von Personen mit anerkannten Berufskrankheiten wird durch die inhalative Belastung der Beschäftigten mit partikulären und faserförmigen Stäuben verursacht. Der derzeit gültige Arbeitsplatzgrenzwert (AGW) für „granuläre biobeständige, schwer lösliche Stäube“ (GBS) von 1,5 mg/m3 für alveolengängige Partikel wird kritisch diskutiert aufgrund des Verdachts, dass auch geringere Mengen an Partikeln schwere Erkrankungen der Lunge verursachen können. Die Bewertung der Faserwirkungen befindet sich aktuell ebenfalls aufgrund der potentiell toxischen Wirkung von vielen verschiedenen, neu entwickelten faserartigen Nanomaterialien in der Diskussion. Die zugrunde liegenden Mechanismen konnten bislang nicht im Detail erklärt werden. Aus diesen Gründen werden dringend neue leistungsfähige und günstige toxikologische Screening-Methoden benötigt. Berücksichtigt man die hohen Kosten und die ethischen Probleme von Tierversuchen, sind leistungsfähige in vitro-Methoden eine notwendige Alternative, mit der die toxischen Eigenschaften von Partikeln und Fasern schnell und günstig charakterisiert werden können. Die Toxizität der Partikel und Fasern wird maßgeblich durch ihre inflammatorischen Eigenschaften bestimmt. Für die akuten und chronischen Partikelwirkungen in vivo ist die Einwanderung von Entzündungszellen in die Lunge ein zuverlässiger toxikologischer Endpunkt. Im Rahmen dieses Projektes wurde die dosisabhängige Chemotaxis von Entzündungszellen als Reaktion auf eine inhalative Partikelexposition in vitro untersucht und in Form eines neuen Assays etabliert. Die so genannte Chemotaxis bezeichnet eine Migration von Zellen, beispielsweise neutrophilen Granulozyten, an den Ort einer entzündlichen Reaktion. Sie wird vermittelt durch Chemokine wie z.B. CXCL8. Zu kultivierten NR8383 Alveolarmakrophagen wurden Partikel und Fasern mit unterschiedlich starker entzündlicher Wirkung gegeben: Bariumsulfat (BaSO4) (Inertkontrolle), Quarz und amorphes Siliziumdioxid (SiO2), Titandioxid (TiO2) (Kristallformen Anatas und Rutil), jeweils in verschiedenen Partikelgrößen und -dosierungen (32 bis 96 µg/cm2) sowie Asbestfasern verschiedenen Ursprungs (1 bis 64 µg/cm2). Die Zellen wurden für 16 Stunden mit den Partikeln und Fasern inkubiert. In dieser Zeit wurden sie von den Makrophagen phagozytiert, die als Reaktion chemotaktische Botenstoffe in das Medium abgaben. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen und die Partikel abzentrifugiert und der Zellüberstand abgenommen. Mithilfe der Überstände wurde die Chemotaxis von unbehandelten NR8383 Zellen und differenzierten HL-60 Zellen induziert. An dieser Reaktion beteiligte Zytokine und Chemokine wurden auf RNA- und Proteinebene identifiziert und quantifiziert. Darüber hinaus wurden die Zytotoxizität der Partikel und Fasern bestimmt (Durchflusszytometrie und Real Time Cell Analyzer) und es fand eine umfangreiche physikochemische Charakterisierung der Partikel und Fasern statt. Die Überstände von mit Partikeln und Fasern inkubierten NR8383 Zellen induzierten eine signifikante und dosisabhängige Chemotaxis von unbehandelten NR8383 Zellen und dHL-60 Zellen. BaSO4 als Inert-Kontrolle löste keine und das schwach inflammatorisch wirksame TiO2-Mineral Anatas nur sehr schwache chemotaktische Wirkungen aus, während Partikel mit einem bekannten hohen inflammatorischen Potenzial eine starke Migration von Immunzellen auslösten (SiO2/Quarz > rutiles TiO2). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurden die Zytokine CCL3, CCL4, CXCL1, CXCL3 sowie TNFα in den untersuchten Proben deutlich hochreguliert. Der Migrationsassay bildet Effekte reproduzierbar und dosisabhängig ab. Er ist leicht zu handhaben und kommt ohne den Einsatz von Primärzellen aus. Der Test bietet die Möglichkeit, inerte und inflammatorische Partikel in vitro zu unterscheiden. Darüber hinaus könnte er zukünftig eine schnelle und kostengünstige Vorstufe zum Tierversuch darstellen und für die Beurteilung der inflammatorischen Wirkung weiterer Partikel und Fasern (z.B. Nanomaterialien) eingesetzt werden. Der Ansatz eignet sich auch für grundlagenorientierte Forschung, da Effekte wie beispielsweise die Freisetzung von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen oder die Expression entsprechender Zellrezeptoren in einem funktionellen Zusammenhang untersucht werden können. Auch der Einfluss modifizierter Partikelparameter (z.B. Änderungen der Morphologie oder der Oberfläche) kann untersucht werden. Inhalation of particles and fibers are a major cause for occupational diseases and deaths. The German general occupational exposure limit (OEL) (1,5 mg/m3) for „respirable, insoluble particles regardless of composition” is currently re-assessed because there is growing evidence that these dusts are capable of toxic effects at relatively low exposure concentrations, implying that the control limit for dusts may not give adequate protection against occupational lung diseases. Toxicity of fibers is also re-evaluated because of the potential adverse health effects of nanofibers to the general environment. The underlying toxicity mechanisms are still not well-understood. As a consequence, there is great need for new efficient and cost-effective toxicological screening methods. Taking into consideration the high costs and the ethical probems of animal testing, reliable high-throughput in vitro screening methods are an attractive option for quick and inexpensive characterization of inflammatory and toxic properties of particles and fibers. The extent of toxic effects of particles and fibers is a consequence of their inflammatory potentials. Accumulation of macrophages and neutrophils in the lung is a key feature of acute and chronic inflammatory reactions following particle exposures in vivo. This study investigates the chemotaxis of inflammatory cells in response to respired particles as a novel in vitro-system to assess particle-related health effects. Chemotaxis means the migration of cells (e.g. immune cells such as neutrophils) towards an inflammatory reaction, mediated by chemokines e.g. CXCL8. NR8383 alveolar macrophages were challenged with particles and fibers causing different inflammatory effects: barium sulfate (BaSO4) (inert control), quartz and silica (SiO2), titanium dioxide (TiO2) (modifications anatase und and rutile), each of different sizes and doses (32 to 96 µg cm-2) and asbestos fibers of different origins (1 to 64 µg cm-2). The alveolar macrophages were challenged for 16 hours. During this time, particles and fibers were phagocytized and messenger molecules were secreted by the macrophages into the culture medium. Cells and particles were removed by centrifugation and the cell supernatants were used to induce cell migration of non-exposed NR8383 rat macrophages and differentiated HL-60 cells (dHL-60 cells). Chemokines and cytokines that play an important role in the inflammatory process inside the lung were determined by quantification of RNA and inflammatory proteins. Cytotoxicity of particles and fibers was determined using flow cytometry and a Real Time Cell Analyzer. A comprehensive physicochemical characterization of the particles and fibers contributed to the validity of the data. The cell supernatants induced significant and dose-dependent cell migration of NR8383 and dHL-60 cells. BaSO4 particles (inert control) induced no and low inflammatory anatase TiO2 only weak chemotactic effects. Particles with known high inflammatory potential induced a strong migration of immune cells (SiO2/quartz > rutile TiO2). CCL3, CCL4, CXCL1, CXCL3, and TNFα were upregulated in response to the various particles to an extent correlating with the chemotactic effects. This new model shows clearly differentiated effects in a highly reproducible and dose-dependent way. The assay is easy to handle and avoids the use of primary cells. Thus, the assay is a useful approach to study inert and inflammatory particles in vitro. Moreover, it may also enable a rapid and cost effective screening of most other existing and newly developed particles and fibers (e. g. nanomaterials) for possible inflammatory effects. It is also useful to gain in-depth understanding of inflammatory signaling as a response to particles and fibers (e.g. release of pro- and anti-inflammatory cytokines and expression of their corresponding cell receptors) and to investigate the influence of different particle parameters (such as morphology or surface area) on inflammatory reactions.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	27.01.2016
Dateien geändert am:	27.01.2016
Promotionsantrag am:	20.08.2015
Datum der Promotion:	26.10.2015