Dokument: Analyse der Funktion der humanen LGDs und hLGD2MR in humanen Zellen und in Drosophila melanogaster

Titel:	Analyse der Funktion der humanen LGDs und hLGD2MR in humanen Zellen und in Drosophila melanogaster
Weiterer Titel:	Analysis of the function of the human LGDs as well as hLGD2MR in human cells and in Drosophila melanogaster
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36949
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160126-110659-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schulz, Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 28,85 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.01.2016 / geändert 22.01.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	hLGD1 und hLGD2 (hLGD: humanes lethal (2) giant discs) gehören einer konservierten Proteinfamilie an. Sie besitzen vier N-terminal gelegene DM14 Domänen und eine C-terminalen C2 Domäne. Lgd aus Drosophila melanogaster hat eine Funktion im endosomalen Transportweg und interagiert mit dem ESCRT-III Protein Shrub. Diese Interaktion ist auch für die hLGDs bekannt, welche mit den Shrub-Orthologen CHMP4A-C interagieren. In dieser Arbeit sollten grundlegende Eigenschaften der hLGDs sowie deren Einfluss auf den endosomalen Transportweg analysiert werden. Zudem sollte auch das eine mentale Retardierung auslösende Allel hLGD2MR näher charakterisiert werden. Dazu wurden proteinbiochemische Untersuchungen sowie Analysen in Drosophila melanogaster und in humanen Zellen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass neben der Struktur auch die Funktion der hLGDs konserviert ist, so unterdrücken sowohl hLGD1 als auch hLGD2 den lgd mutanten Phänotyp in Drosophila melanogaster. Die Struktur-Funktionsanalyse wies nach, dass die DM14 Domänen und die C2 Domäne der hLGDs essentiell sind. Sowohl die DM14 Domänen als auch die C2 Domäne von hLGD2 besitzen eine Funktion in der Stabilität des Proteins. Bei hLGD1 hat die C2 Domäne eine andere bislang unbekannte Funktion. Wie auch Lgd sind die hLGDs cytoplasmatische Proteine. Durch die Überexpression der hLGDs und ihrer Deletionskonstrukte konnte gezeigt werden, dass auch die hLGDs am endosomalen Transportweg beteiligt sind. Dies zeigt beispielsweise die Entstehung von stark vergrößerten späten Endosomen, bzw. Lysosomen bei der Überexpression von hLGD2ΔDM14 oder den hLGDΔC2s. Dieser dominant negative Effekt auf den endosomalen Transportweg deutet an, dass die hLGDs an der Regulation des spät endosomalen/lysosomalen Transportweges beteiligt sind. Zudem zeigt sich bei der Expression von hLGD1ΔC2 und teilweise auch bei der Expression von hLGD2ΔC2 eine bislang noch nicht beobachtete Lokalisation von CHMP4B, welches sich in den stark vergrößerten Vesikeln befindet. Weitere Analysen in dieser Arbeit deuten daraufhin, dass das eine mentale Retardierung auslösende hLGD2 Allel zu einem kompletten Funktionsverlust des Proteins führt. Zudem konnte gezeigt werden, dass keine Assoziation der mentalen Retardierungskonstrukte mit endosomalen Markern in humanen Zellen zu beobachten ist. Dennoch scheint deren Expression den spät endosomalen/lysosomalen Transportweg zu stören. In dieser Arbeit konnte für die hLGDs ein eindeutiger Bezug zum endosomalen Transportweg nachgewiesen werden. Möglicherweise üben sie eine regulatorische Rolle aus, eventuell über ihre Interaktion mit CHMP4B. Weitergehende Analysen sind notwendig, um die genaue Wirkungsweise der hLGDs näher zu charakterisieren. Dadurch könnten weitere Mechanismen der Regulation des endosomalen Transportweges, bzw. der ESCRT-Komplexe ermittelt werden. Dies wiederum könnte für ein besseres Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen oder der Tumorbildung beitragen. hLGD1 and hLGD2 (hLGD: human lethal (2) giant discs) belong to a conserved protein family, which consists of four n-terminal DM14 domains and one c-terminal C2 domain. Drosophila melanogaster Lgd plays a role in the endosomal pathway and interacts with the ESCRT-III protein Shrub. It is also known that the hLGDs interact with the Shrub- orthologs CHMP4A-C. In this study, basic characteristics of the hLGDs and their influence on the endosomal pathway have been analysed. Furthermore one allel of hLGD2, hLGD2MR, which causes a non-syndromic mental retardation, have been characterised using proteinbiochemistry as well as analysis in Drosophila melanogaster and human cells. The results showed that hLGD1 and hLGD2 can suppress the lgd mutant phenotyp to different extents. So not only the structure but also the function of the hLGDs is conserved. The structure-/function analysis revealed that the DM14 domains and also the C2 domain of the hLGDs are essential for their function. The DM14 domains as well as the C2 domain of hLGD2 play a role in the stability of the protein. The C2 domain of hLGD1 has a different for yet unknown function. Like Lgd, the hLGDs are cytoplasmatic proteins. The overexpression of the hLGDs and their deletion constructs showed that the hLGDs are involved in the endosomal trafficking. For example this was demonstrated by the development of huge enlarged late endosomes, respectively lysosomes, when hLGD2ΔDM14 or the hLGDΔC2s are overexpressed. This dominant negative effect on the endosomal pathway implies the involvement of the hLGDs at the regulation of the late endosomal/lysosomal pathway. Furthermore the expression of hLGD1ΔC2 and in some cases the expression of hLGD2ΔC2 revealed a so far unobserved localisation of CHMP4B, which is localised within the enlarged late endosomes. Moreover, the allel of hLGD2, which leads to a mental retardation, is causing a loss-of-function. Furthermore it was shown, that there is no assoziation of the mental retardation constructs with endosomal markers in human cells. Nevertheless the expression of the mental retardation constructs seems to disturb the late endosomal/lysosomal pathway. This study revealed an obvious connection of the hLGDs to the endosomal pathway. Maybe they have a regulatory role, eventually due to their interaction with CHMP4B. Further analyses are necessary to characterise the specific function of the hLGDs. Thereby it is possible to reveal additional mechanisms of the regulation of the endosomal pathway, respectively the ESCRT-III complexes. As a result, there might be a clearer understanding of neurodegenerative diseases or cancer.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	26.01.2016
Dateien geändert am:	26.01.2016
Promotionsantrag am:	10.08.2015
Datum der Promotion:	05.11.2015