Dokument: Glycokonjugat-Transporter in Mycobakterien

Titel:	Glycokonjugat-Transporter in Mycobakterien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36840
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160122-142249-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wozniczka, Milena [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.01.2016 / geändert 19.01.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Obwohl das Tuberkulose verursachende Bakterium Mycobacterium tuberculosis seit mehr als 130 Jahren bekannt ist, sind noch viele Aspekte von Virulenz und Pathogenese ungeklärt. Beispielsweise ist unsicher, welche Nährstoffe dem Bakterium im Wirt während der verschiedenen Infektionsphasen zur Verfügung stehen und welche Kohlenstoffquellen es im Phagosom der Makrophagen nutzt. Importer vom Typ der ATP-Bindekassetten-(ABC)-Transporter sind eine wichtige Klasse von Permeasen, die den Import von Substanzen in bakterielle Zellen vermittelt. Von einigen ABC-Exportern wird vermutet, dass sie in den Export von Zellwandbestandteilen involviert sind oder möglicherweise dem Efflux von Antibiotika dienen. Neben den ABC-Transportern gibt es auch Flippasen, die unabhängig von der Hydrolyse von ATP-Molekülen über die Cytoplasmamembran transportieren können. Hierzu zählen beispielsweise Flippasen vom Glucosyltransferase-A-(GtrA)-Typ, die lipidgebundene Zucker über die Cytoplasmamembran translozieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von fünf Permeasen: zwei Importern und zwei Exportern des ABC-Typs sowie einer ATP-unabhängigen, GtrA-ähnlichen Flippase. Die Aufklärung der genauen Funktion der Translokasen sollte helfen, ihre Potentiale als Antibiotikawirkorte einzuschätzen. Hierzu wurden umfangreiche molekulargenetische Manipulationen an Mycobakterien vorgenommen. Insgesamt wurden drei Transporterdeletionsmutanten und vier konditionale Mutanten in M. tuberculosis sowie zwei konditionale Mutanten in Mycobacterium smegmatis erzeugt und in der vorliegenden Arbeit untersucht. Für den ABC-Importer UgpAEBC war Glycerin-3-phosphat (G3P) als Substrat postuliert worden. Diese Vermutung kann auf der Basis der nun vorliegenden Daten ausgeschlossen werden. Weder die im Rahmen der Doktorarbeit etablierte Transporterdeletionsmutante DugpAEBC, die ohne Wachstumsdefekt in vitro blieb, noch der Wildtyp von M. tuberculosis konnten G3P gut als singuläre Kohlenstoffquelle verwerten. Das später als mögliches Substrat postulierte Glycerophosphocholin war noch weniger als Kohlenstoffquelle geeignet. Für den ABC-Importer Rv2041c-Rv2040c-Rv2039c-Rv2038c konnte ebenfalls eine Transporter-deletionsmutante in M. tuberculosis ohne Wachstumsdefekt erzeugt werden. Das durch diesen Importer transportierte Substrat konnte in phänotypischen Microarrays nicht identifiziert werden. Da keine Akkumulation von Zuckermolekülen oder Glycokonjugaten in zellfreien Kulturüberständen nachgewiesen werden konnte, ist eine eventuelle Recycling-Funktion des Transporters für freigesetzte Zucker bakteriellen Ursprungs unwahrscheinlich. DRv2041c-Rv2040c-Rv2039c-Rv2038c zeigte in Niedrig-Dosis-Mausinfektionen keinen attenuierten Phänotyp. Es gibt jedoch erste Hinweise auf eine möglicherweise starke Attenuierung im nicht-humanen Primatenmodell. Für den ABC-Exporter Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c wurden aufgrund der postulierten Essentialität zunächst konditionale Mutanten im TetON-TetOFF-System erzeugt. In konditionalen Mutanten wird ein synthetischer Promotor mit vier Operatoren vor dem Gen von Interesse inseriert. Die Transkription des Gens kann nun mithilfe eines reversibel in Abhängigkeit von Anhydrotetracyclin (Atc) bindenden Repressors reguliert werden. Da die konditionalen Mutanten kein apparent Atc-abhängiges Wachstum zeigten, wurde eine Deletion der Transporterkomponenten Rv1457c-Rv1458c in M. tuberculosis vorgenommen, die ohne Wachstumsdefekt in vitro möglich war. Der Phänotyp von DRv1457c-Rv1458c wurde mittels Immunoblotting auf Lipoarabinomannan (LAM) überprüft. Das später postulierte Substrat LAM konnte über diesen Nachweis ausgeschlossen werden, da die Signalstärken zwischen Wildtyp und Deletionsmutante unverändert blieben. Darüber hinaus konnte für DRv1457c-Rv1458c ein attenuierter Phänotyp in der Infektion von THP-1-Makrophagen mit einhergehendem veränderten Zytokinprofil nachgewiesen werden. Nach Infektion mit der Deletionsmutante wurden deutlich abgeschwächte Signale für MCP-1 und IL-8 gefunden. Im Fall des ABC-Exporters Rv3781-Rv3783 und des Homologs Msmeg_6366-Msmeg_6369 ist es gelungen, konditionale Mutanten in M. tuberculosis und Mycobakterium bovis BCG bbzw. M. smegmatis zu erzeugen, deren Wachstum strikt Atc-abhängig verlief. Die Essentialität der Gene Rv3781-Rv3783 und Msmeg_6366 wurde damit sicher nachgewiesen. Mithilfe der konditionalen Mutanten wurde im Immunoblotting indirekt gezeigt, dass der Transporter möglicherweise den Export von Arabinogalactan (AG) vermittelt. In den Mutanten verstärkte sich mit zunehmendem Silencing der LAM-Anteil. Es ist denkbar, dass LAM als Arabinoseshunt fungiert, indem es Arabinosemoleküle übernimmt, die zur Synthese von AG nicht verwendet werden. Für die ATP-unabhängige Flippase Msmeg_1817 in M. smegmatis und ihr Homolog Rv3277 in M. tuberculosis konnte die Essentialität durch die Generierung konditionaler, Atc-abhängig wachsender Mutanten nachgewiesen werden. Die untersuchten konditionalen Mutanten in M. smegmatis und M. tuberculosis zeigten mit zunehmendem Silencing auch verringerte Anteile bzw. veränderte Kompositionen der Decaprenolphosphoarabinose (DPA)- und Decaprenolphosphomannose (DPM)-abhängigen Zellwandbestandteile. In Immunoblots konnte gezeigt werden, dass die mutmaßlich downstream des Flippings gelegenen Produkte wie LAM und Phosphatidyl-myo-inositolmannoside abnehmen, je stärker die Mutante gesilencet wird. Komplementationsversuche bestätigten die funktionelle Homologie der beiden Gene. Es handelt sich daher vermutlich sowohl bei Rv3277 als auch bei Msmeg_1817 um eine Flippase, die lipidverknüpfte Zucker wie DPA und DPM von der cytoplasmatischen auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran transloziert. Durch ihren starken Einfluss auf wichtige Zellwandbestandteile der Mycobakterien könnte diese Translokase einen guten, neuartigen Antibiotikawirkort darstellen. The causative agent of tuberculosis, the Mycobacterium tuberculosis bacterium is known for more than 130 years. However, many aspects of ist virulence and pathogenesis still remain to be elucidated. It is not known which nutrients are available during the different stages of infection and which of the available nutrients inside the phagosomes of macrophages are used by the bacterium. Importer of the ABC- (ATP-binding-cassette)-type are an important class of permeases, mediating the import of different substances into the bacterial cell. Some of the ABC-exporters are discussed to be either involved in the export of cell wall components or in the efflux of antibiotics. Besides ABC-transporters also flippases, which act independently from hydrolysis of ATP, are involved in translocation processes across the cytoplasmic membrane. Flippases of the glycosyltransferase-A-(grtA)-type are flipping lipid-bound sugars across the cytoplasmic membrane. Aim of this study was the characterization of five permeases: two importers and two exporters of the ABC-type as well as one GtrA-like flippase. Elucidating the function of these tranlocases should help to assess their features as drug-targets. Therefore, mycobacteria were comprehensively genetically manipulated, which resulted in the generation and characterization of three knock-out-mutants and four conditional mutants in M. tuberculosis as well as two conditional mutants in Mycobacterium smegmatis. Glycerol-3-phopshate (G3P) was the postulated substrate of the ABC-importer UgpAEBC. Within this study it could be shown, that neither the wildtype of M. tuberculosis nor the knock-out-mutant DugpAEBC, which showed no apparent growth defect in vitro, was capable of using G3P as a sole carbon source. Therefore G3P could be ruled out as the potential substrate of this importer. The later postulated substrate glycerophosphocholine was even less utilizable as a sole carbon source for the bacterium. A deletion mutant of the ABC-importer Rv2041c-Rv2040c-Rv2039c-Rv2038c was generated. but the transported substrate could not be defined in phenotypic microarrays. A potential recycling-function of this transporter seems unlikely, as no accumulation of sugars or glycoconjugates could be found in cell-free supernatants of liquid cultures. The DRv2041c-Rv2040c-Rv2039c-Rv2038c showed no attenuation in a low-dose aerosol mouse infection model. However, there are hints of a strong attenuation in a non-human primate model. The postulated essentiality of the ABC-exporter Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c lead to the generation of conditional mutants in the TetON-TetOFF-system. In these conditional mutants a synthetic promotor with four operators is inserted immediately before the gene of interest. The transcription of this gene can now be silenced in presence or absence of an anhydrotetracyclin-(Atc)-dependent reversibly binding repressor. As the conditional mutants showed no Atc dependent growth, a deletion of Rv1457c-Rv1458c was carried out. The resulting knock-out Rv1457c-Rv1458c showed no growth defect in vitro. Via immunoblotting the phenotype was examined regarding the postulated substrate lipoarabinomannan (LAM). The signal for LAM showed no differences between DRv1457c-Rv1458c compared to the wildtype M. tuberculosis. In a THP-1-macrophage infection model the mutants showed an altered cytokine profile with weakened signals for MCP-1 and IL-8. Conditional mutants of the ABC-exporter Rv3781-Rv3783 and its homologue Msmeg_6366-Msmeg_6369 were generated in this study in M. tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG and in M. smegmatis, respectively. All mutants showed a strictly Atc-dependent growth behaviour, which proved the essentiality of these genes. Via immunoblotting it was shown, that this transporter might be involved in the export of arabinogalactan (AG). When silenced, the mutants showed an increasing signal for LAM. This leads to the conclusion, that LAM might be acting as a shunt mechanism for arabinose molecules, which are not used in the biosynthesis of AG. The essentiality of the ATP-independent flippase Msmeg_1817 in M. smegmatis and its homologue Rv3277 in M. tuberculosis could be proven via the generation of conditional mutants showing a strictly Atc-dependent growth. When silenced, the conditional mutants showed decreasing signals and altered compositions of cell wall components, that depended on decaprenolphosphoarabinose (DPA)- and decaprenolphosphomannose (DPM), such as LAM and phosphatidyl-myo-inositolmannosides. Complementation experiments corroborated the functional homology of Msmeg_1817 and Rv3277. Presumably, Msmeg_1817 and Rv3277 are coding for a flippase, that translocates DPA and/or DPM from the cytoplasmic to the periplasmic side of the cytoplasmic membrane. With its strong effect on mycobacterial cell wall components this translocases could be suitable as a potential new drug target.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.01.2016
Dateien geändert am:	22.01.2016
Promotionsantrag am:	28.10.2015
Datum der Promotion:	13.01.2016