Dokument: Mechanisms of hemolysin A Type 1 secretion in Escherichia coli

Titel:	Mechanisms of hemolysin A Type 1 secretion in Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36796
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160114-100840-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Lenders, Michael [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,85 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2016 / geändert 13.01.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Lutz Schmitt [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	ABC transporter, membrane fusion protein, haemolysin A, haemolysin B, haemolysin D, type 1 secretion, secretion rate, directionality
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Eine der essentiellen Nanomaschinerien in Gram-negativen Bakterien sind die Typ I Sekretionssysteme (T1SS). Sie sekretieren ein breites Spektrum an Substraten aus dem Cytoplasma, über die innere und äußere Membran, direkt in den extrazellulären Raum. Der Transportprozess erfolgt ungefalten und in einen Schritt ohne ein periplasmatisches Intermediat. Die Vielfalt der sekretierten Proteine reicht von 78 bis 8682 Aminosäuren in der Größe und umfasst Hämophore, Lipasen, Hüllproteine, Nodulations- und Adhäsionsproteine sowie Toxine. Allen Substraten gemein ist das C-terminale Sekretionssignal, welches weder während noch nach der Sekretion abgeschnitten wird. Eines der am besten charakterisierten T1SS Substrate ist das Zellen-lysierende Toxin Hämolysin A (HlyA). HlyA gehört zu der repeats in toxin (RTX) Proteinfamilie. Sein Sekretionssystem besteht aus dem äußeren Membranprotein (OMP) TolC, das eine Pore durch die äußere Membran bildet, dem ABC-Transporter Hämolysin B (HlyB) in der inneren Membran, der den Transportprozess antreibt und das Substrat erkennt, und dem Membranfusionsprotein (MFP) Hämolysin D (HlyD), das TolC und HlyB miteinander verbindet und den periplasmatischen Raum überbrückt. Zusammen bilden diese Proteine das HlyA T1SS. Während dieser Doktorarbeit wurde die Direktionalität und die Rolle des Sekretionssignals des HlyA Transportes charakterisiert. Die Fusion des gesteigerten grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) an den N-Terminus von HlyA bzw. HlyAc (C-terminale 218 Aminosäuren von HlyA) resultierte in einer Verstopfung des gesamten HlyA T1SS. Markierungen der Termini und Fluoreszenzmikroskopie bestätigten, dass der C-Terminus als erstes an die Zelloberfläche gelangt. Ferner legten Deletionen des Sekretionssignals nahe, dass das Sekretionssignal essentiell für die Einführung des Substrates in den Translokator ist. Außerdem erlaubten die verstopfen und markierten Transporter die Quantifizierung der aktiven HlyA T1SS pro Bakterienzelle. Dadurch konnte die Sekretionsrate bezogen auf sekretierte Aminosäuren pro Sekunde und Sekretionssystem quantifiziert werden. Die Sekretionsrate ist nicht beeinflusst von der Proteinlänge, der Anzahl an Glycin-reichen Wiederholungen und der extrazellulären Kalziumkonzentration. Zusätzlich konnten HlyB Mutanten und die Fusionsproteine zeigen, dass die ATP-Hydrolyse essential für das Einfädeln des Substrates in das HlyA T1SS ist. One of the most essential nanomachineries in Gram-negative bacteria are the Type I secretion system (T1SS). They secrete a broad range of substrates from the cytoplasm across the inner and outer membrane directly into the extracellular space. The transport process occur unfolded in one step without any periplasmic intermediate. The variety of secreted proteins range in size from 78 to 8682 amino acids and contain hemophores, lipases, S-layer proteins, nodulation and adhesion factors as well as toxins. All substrate in common is the C-terminal secretion signal which is not cleaved during or after secretion. One of the best characterized T1SS substrates is the cell lysing toxin hemolysin A (HlyA). HlyA belongs to the repeats in toxin (RTX) protein family. Its secretion system consists of the outer membrane protein (OMP) TolC that builds a pore through the outer membrane, the inner membrane ABC transporter hemolysin B (HlyB) that energizes the transport process and recognizes the substrate and the membrane fusion protein (MFP) hemolysin D (HlyD) that connects TolC and HlyB and bridges the periplasmic space. Together these proteins build up the fully assembled HlyA T1SS. During this doctoral research, the role of the secretion signal and the directionality of the HlyA transport was characterized. An enhanced Green Fluorescence Protein (eGFP) fusion to the N-terminus of HlyA respectively HlyAc (C-terminal 218 amino acids of HlyA) results in stalling of the HlyA T1SS. Different labeling of the termini and fluorescence microscopy confirm that the C-terminus appears first at the cell surface. Further, secretion signal deletions of this fusions indicated that the secretin signal is essential for threading the substrate inside the translocator. Moreover, stalled and labeled transporters allow the quantification of active HlyA T1SS per bacterial cell. As a consequence, the rate of secreted substrate amino acids per second and secretion system can be quantified. The secretion rate is unaffected by the length of the protein, the amount of glycine rich repeats and the extracellular calcium concentration. Additionally, fluorescence microscopy with HlyB mutant and the fusion proteins determines that ATP hydrolyzes is essential for substrate threading into the HlyA T1SS as well.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	14.01.2016
Dateien geändert am:	14.01.2016
Promotionsantrag am:	25.11.2015
Datum der Promotion:	16.12.2015