Dokument: Nachweis lebender zirkulierender Tumorzellen mittels viraler Transduktion
| Titel: | Nachweis lebender zirkulierender Tumorzellen mittels viraler Transduktion | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36708 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160113-095418-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Pietsch, Julia [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stoecklein, Nikolas Hendrik [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Metastasierung ist für die meisten krebsbedingten Todesfälle verantwortlich. Die molekularen Mechanismen der systemischen Tumorerkrankung sind weiterhin noch nicht völlig aufgeklärt. Die Wahl einer Therapie basiert i. d. R. auf den biologischen Eigenschaften des Primärtumors. Die Entscheidung für eine Therapie auf Grundlage der metastatischen Erkrankung kann von größerem Nutzen für den Patienten sein. Im Blut zirkulierende Tumorzellen (CTCs) als Vorläuferzellen der Metastasen sind vergleichsweise leicht zugänglich und damit weniger aufwändig als invasive Gewebebiopsien. Sie können als sogenannte liquid biopsy zur Auswahl geeigneterer und personalisierter Therapien beitragen, die möglicherweise eine Metastasierung verhindern oder in einem frühen Stadium bekämpfen. Die Detektion und Isolierung von CTCs stellt trotz bereits etablierter Detektions- und Isolierungsmethoden weiterhin eine große Herausforderung dar. Denn CTCs sind sehr selten und bis heute gibt es keinen spezifischen CTC Marker. Daher greifen viele bestehende Systeme bei der Detektion und Isolierung der CTCs auf epitheliale Marker wie das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) zurück. Die Expression dieses Proteins kann aber z. B. aufgrund einer epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) auf CTCs verloren gehen, so dass EpCAM negative Zellen nicht detektiert werden. Ein weiterer Nachteil der meisten bestehenden CTC Detektionssysteme ist, dass keine vitalen Zellen identifiziert und isoliert werden können, so dass eine Kultivierung der CTCs zur Untersuchung ihrer funktionellen Eigenschaften nicht möglich ist. Somit bleiben Fragen bezüglich des tumorinitiierenden Potentials und einer möglichen Chemoresistenz der isolierten CTCs unbeantwortet.
Ausgehend von diesen limitierenden Faktoren bestehender CTC Detektionssysteme wurde in der vorliegenden Arbeit ein EpCAM unabhängiges Detektionssystem für vitale CTCs etabliert. Hierfür wurden humane Adenoviren verwendet, die einen natürlichen Tropismus für epitheliale Zellen aufweisen. Durch das zur Markierung verwendete GFP konnten ausschließlich lebende Zellen detektiert werden. Von zunächst zwei untersuchten adenoviralen Vektoren (Ad5 und Ad5/3) erwies sich das tropismusmodifizierte Ad5/3 Virus aufgrund einer sehr überzeugenden Infektionseffizienz und mikroskopischer Auswertbarkeit als ideal. Die epithelspezifische Infektion konnte anhand zahlreicher Experimente belegt werden. In Einbringungsexperimenten mit Tumorzelllinien konnten sehr gute Wiederfindungsraten, vergleichbar mit etablierten CTC Nachweissystemen, beobachtet werden. Bei der parallelen Analyse von DLA Proben (DLA = Diagnostische Leukapherese) mittels virusbasiertem Detektionssystem und CellSearch® wurden mehr CTC positive Proben nach adenoviraler Infektion beobachtet (61.3 % vs. 29 %). Darüber hinaus war in den meisten Fällen die Anzahl der adenoviral detektierten CTCs pro Probe höher als nach Detektion mit dem CellSearch® System. Lediglich in Proben von Mammakarzinom Patientinnen war die Detektionsrate mittels CellSearch® höher (DLA (Virus): Mittelwert = 1, n = 5; DLA (CellSearch®): Mittelwert = 41, n = 5). Ein weiterer Vergleich beider Detektionssysteme mit Blutproben von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom zeigte ein vergleichbares Bild (CellSearch® : Mittelwert = 6.8, n = 5; Virus: Mittelwert = 2, n = 5). Ein Grund für die höhere Detektionsrate von CellSearch® bei Mammakarzinom Patientinnen kann durch eine mögliche Detektion von apoptotischen Zellen in diesem System erklärt werden. Die genomische Analyse der CTC einer Patientin mit metastasiertem Mammakarzinom mittels Array CGH zeigte tumortypische Kopienzahlveränderungen und bestätigte den malignen Charakter dieser Zelle. Insgesamt erwies sich die genomische Einzelzellanalyse von virusbasiert detektierten Zellen jedoch als schwierig. Dies deutet auf den Optimierungsbedarf des verwendenden Arbeitsablaufs für diese spezielle Anwendung hin. Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit der Grundstein für eine alternative, EpCAM unabhängige CTC Detektionsmethode gelegt werden, die es ermöglichte, vitale CTCs zu identifizieren und darüber hinaus erlauben sollte, diese extrem seltenen Zellen in Kultur zu expandieren.Metastasis causes most cancer related deaths. Molecular mechanisms of the systemic tumor disease are still unresolved. Usually, selection of therapy is based on biological characteristics of the primary tumor. Decision for a therapy based on metastatic disease could be of great use for a patient. Regarded as precursor cells of metastases, circulating tumor cells (CTCs) are more readily accessible than invasive tissue biopsies. As so-called liquid biopsy, CTCs can contribute to selection of more suitable and personalized therapies, which may prevent metastasis or combat it at an early stage. Detection and isolation of CTCs is still quite challenging despite established detection and isolation methods, since CTCs are quite rare and until now no CTC specific marker exists. Therefore, many existing detection and isolation systems rely on epithelial markers like epithelial adhesion molecule (EpCAM). However, EpCAM is not expressed on every CTC, e. g. due to down regulation during epithelial mesenchymal transition (EMT). Another drawback of most standard CTC detection systems is that they do not allow isolation of viable cells, hindering their cultivation for functional analysis. Consequently, questions such as testing their tumor initiating potential and their chemoresistence remain largely unanswered. Based on these limiting factors of existing CTC detection methods an EpCAM independent detection system for viable cells was established. This detection system is based on the use of human adenoviruses with natural tropism for epithelial cells. Infected vital cells express subsequently the GFP tag enabling their identification. Hence, only viable cells are detected. Of initially two investigated adenoviral vectors (Ad5 and Ad5/3) the tropism modified Ad5/3 virus displayed higher infection efficiency and resulted in brighter signal upon microscopic evaluation. The epithelial specific infection could be validated on the basis of numerous experiments. In spiking experiments the adenoviral detection system revealed an excellent recovery rate similar to established detection systems. In parallel analysis of DLA samples (DLA = diagnostic leukapheresis) by virus based detection system and CellSearch®, higher CTC detection rates could be observed by use of adenoviral infection (61.3 % vs. 29 %). Furthermore, in most cases the number of adenoviral detected CTCs per sample was increased compared to the CellSearch® system. Only in samples of breast cancer patients the detection rate was higher by the use of CellSearch® (DLA (virus): mean = 1, n = 5; DLA (CellSearch®): mean = 41, n = 5). An additional comparison of both detection systems with blood samples of metastatic breast cancer patients resulted in comparable findings (CellSearch® : mean = 6.8, n = 5; virus: mean = 2, n = 5). The higher detection rate with the use of CellSearch® might result from detection of apoptotic cells compared to the adenoviral detection system. Array CGH analysis of a CTC detected by the adenovirus in a sample from metastatic breast cancer confirmed the malignant origin of that cell. However, single cell genetic analysis of cells detected by the currently used workflow was difficult and indicated that further optimization of the currently workflow will be necessary. However, in the present study foundation was laid for an alternative, EpCAM independent detection method for CTCs, which further may provide the opportunity for more effective CTC cultivation. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.01.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.01.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.08.0015 | |||||||
| Datum der Promotion: | 12.11.2015 |
