Dokument: Entwicklung einer Toolbox von FRET-basierten Biosensoren für die Metabolitanalytik
| Titel: | Entwicklung einer Toolbox von FRET-basierten Biosensoren für die Metabolitanalytik | |||||||
| Weiterer Titel: | Development of a toolbox of FRET-based biosensors for metabolite analysis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36698 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160111-100256-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Steffen, Victoria [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | FRET-basierte Biosensoren, Metabolitanalytik | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Durch die stetige Entwicklung neuer biotechnologischer Prozesse zur Herstellung von Feinchemikalien steigt der Bedarf an Biosensoren als schnelles Messwerkzeug insbesondere im Hochdurchsatzscreening und für Einzelzellanwendungen. In dieser Arbeit wurde eine Toolbox genetisch kodierter, FRET-basierter Biosensoren für die Metabolitanalytik entwickelt, die nach dem „Venus-Fliegenfallen“-Prinzip funktionieren.
Dazu wurden zwei Biosensorprototypen für Lysin basierend auf dem Lysin-/ Arginin /Ornithin-Bindeprotein (LAO-BP) aus E. coli entwickelt, die von zwei Fluoreszenzproteinen (FPs: ECFP und Citrine) flankiert wurden. Die Sensitivität und scheinbare Affinität wurde durch Variation eines starren bzw. flexiblen Linkers zwischen BP und FP optimiert. Die erste Toolbox enthielt das native LAO-BP, bei dem das Bindeereignis zu Lysin nicht in einem FRET-Effekt resultierte, weil die FPs zu wenig Beweglichkeit hatten, bzw. nicht optimal zueinander orientiert waren. Mit dieser Sensortoolbox ließen sich jedoch unabhängig vom BP Lysinkonzentrations-abhängige Effekte messen, die auf der Umgebungsänderung der FPs beruhen. Diese Toolbox ist für die Messung von Lysinkonzentrationen von 10 – 400 mM geeignet. Für die zweite Toolbox wurde das LAO-BP zirkular permutiert, um eine bessere Orientierung der FPs zu ermöglichen. Dieses Konzept war erfolgreich und der erste Sensorprototyp dieses Typs erreichte bereits hohe Empfindlichkeit. Durch Einbau eines starren und eines flexiblen Linkers in allen möglichen Kombinationen konnte die Empfindlichkeit und die scheinbare Affinität über weite Bereiche variiert werden. Diese 2. Toolbox ist für die Messung von Lysinkonzentrationen von 0,3 µM - 2 mM geeignet. Nachteilig bei der 2. Toolbox war eine verringerte Stabilität dieser Sensoren, bedingt durch die Permutation im BP. Dadurch neigten die Sensorproteine zu thermischem Zerfall. Allerdings waren sie auch über 90 min bei 30 °C stabil und konnten daher im zweiten Teil der Arbeit in atline Messungen in der Stammoptimierung im BioLector®-Kultivierungssystem erprobt werden. Es wurde ein Modellprozess entwickelt, in dem am Beispiel des in dieser Arbeit entwickelten Prototyp-Lysinsensors (ohne Linker, 0-perm-0-Sensor) Lysin während eines typischen Produktionsprozesses im Zellüberstand von Corynebacterium glutamicum atline detektiert werden konnte. So wurde die Palette der bisherigen instrumentellen und kolorimetrischen Analysemethoden zur Konzentrationsbestimmung in Kulturüberständen mit den FRET-basierten Biosensoren als neues Werkzeug ergänzt. Weiterhin wurde die Anwendbarkeit dieses Biosensors in Ganzzellsystemen (E. coli) als Sensorzellen getestet und gezeigt, dass die Biosensoren in den Messzellen eine reproduzierbare intrazelluläre Signaländerung auf extrazelluläres Lysin zeigen.Due to the continuous development of emerging biotechnological processes for the production of fine chemicals, there is a growing demand for biosensors as robust measurement tools especially in high throughput screening or single cell analysis. This thesis presents a toolbox of genetically encoded FRET-based biosensors for metabolite analysis based on the “Venus-flytrap” principle. For this purpose two biosensor prototypes affine towards lysine were developed. These biosensors comprise of a lysine- / arginine- / ornithine-binding protein (LAO-BP) from E. coli flanked by two fluorescent proteins (FPs: ECFP, Citrine). The sensitivity and apparent affinity was optimized by varying flexible and rigid linkers between LAO-BP and FPs. The first toolbox was based on the native LAO-BP in which a binding event does not result in a FRET-effect because either the FPs are not flexible enough or are not orientated in an optimal way. Nevertheless this sensor toolbox allowed the measurement of effects dependent on lysine concentrations caused by variation of the FP environment. This toolbox is suited for lysine determination at concentrations ranging from 10 to 400 mM. To build the second toolbox a circular permutated LAO-BP was used to orient the FP in a more favourable way. This concept was successful and the first prototype already exhibits high sensitivity. The sensitivity and apparent affinity of the sensor could be varied in a wide range by assembling flexible and rigid linkers in all possible combinations. The second toolbox is suited for lysine determination at concentrations ranging from 0.3 µM up to 2 mM. Disadvantageously the second toolbox revealed a decreased stability of the sensors due to the permutated BP. Although the sensor proteins are prone to thermal degradation, they exhibit stability longer than 90 minutes at 30 °C. Therefore, in the second part of the thesis they could be used for atline measurements for strain optimisation in a BioLector® cultivation system. The prototype (0-perm-0-Sensor) developed in this thesis was successfully applied for atline detection of lysine concentration in a Corynebacterium glutamicum culture supernatant during a typical production process. With this the previous portfolio of instrumental and colorimetric methods for concentration determination in culture supernatant could be expanded with the addition of FRET-based biosensors as new measurement tools. Furthermore, the applicability of these biosensors was evaluated in whole cell systems in E. coli. It was revealed that the biosensors in whole cells showed a reproducible intracellular signal change in response to extracellular lysine. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.01.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.01.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.05.2015 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.10.2015 |
