Dokument: Charakterisierung und Optimierung von FMN-bindenden Fluoreszenzproteinen als molekulare Reporterproteine

Titel:	Charakterisierung und Optimierung von FMN-bindenden Fluoreszenzproteinen als molekulare Reporterproteine
Weiterer Titel:	Characterization and optimization of FMN-binding fluorescent proteins as molecular reporter proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36618
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170106-100000-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wingen, Marcus [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.12.2015 / geändert 17.12.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Karl -Erich Jaeger [Gutachter] Prof. Dr. Joachim Ernst [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Über die letzten zwei Jahrzehnte hinweg haben sich Fluoreszenzproteine zu einem Grundpfeiler in der modernen Erforschung biologischer Systeme entwickelt. Sie können verwendet werden, um zum Beispiel Genexpressionen, Proteinlokalisationen oder komplexe zellphysiologische Prozesse zu studieren. Die größte Klasse von Fluoreszenzproteinen bildet die GFP-Familie, deren zahlreiche Varianten von Proteinen aus der Qualle A. victoria und verschiedenen Anthozoa-Spezies abgeleitet sind. FMN-bindende Fluoreszenzproteine (FbFPs), die vor wenigen Jahren aus blaulichtsensitiven LOV-Domänen, die in Pflanzen und vielen Bakterien bekannt sind, entwickelt wurden, bilden eine weitere Klasse von Fluoreszenzproteinen, die die Sammlung der vorhandenen Fluoreszenzproteine durch ihre Unabhängigkeit von molekularem Sauerstoff komplementiert. In dieser Arbeit wurden neuartige FbFP Varianten erzeugt und charakterisiert, die neue und einzigartige Eigenschaften aufweisen. Die beiden etablierten Proteine EcFbFP und Pp2FbFP wurden durch Zufalls- und ortsgerichtete Mutagenese verbessert, um Varianten mit erhöhter in vivo Fluoreszenz, blauverschobenen Spektren und – im Falle von Pp2FbFP – mit einer erhöhten Fluoreszenz-Quantenausbeute hervorzubringen. Um FbFPs mit rotverschobenen Emissionsspektren hervorzubringen, wurden alle verfügbaren FbFPs auf die Fähigkeit hin untersucht, das Flavinanalogon Roseoflavin zu binden und ein rotverschobenes Fluoreszenzsignal zu erzeugen. In diesen Studien konnte gezeigt werden, dass Pp1FbFP RoFMN effizient binden kann, wodurch ein helles Fluoreszenzsignal mit einem Emissionsmaximum bei λ = 540 nm erzeugt wird, was eine signifikante Rotverschiebung verglichen mit FbFPs mit FMN darstellt. Die Fähigkeit des Proteins, zwei verschiedene Chromophore mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften zu binden, macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Entwicklung eines FbFP-basierten Sekretionsmarkers. Um die Anwendbarkeit von Fluoreszenzproteinen auf das Gebiet der oftmals anaerob lebenden thermophilen Organismen auszuweiten, wurde eine Reihe neuartiger FbFPs aus LOV-Domänen entwickelt, die in solch Thermophilen gefunden wurden. Mit Schmelztemperaturen von > 75 °C weisen diese Proteine eine signifikant höhere Thermostabilität als andere FbFPs auf und sollten theoretisch stabil genug für die Anwendung als Fluoreszenzreporter in thermophilen Organismen sein. Over the course of the last two decades, fluorescent reporter proteins have become a cornerstone of modern biological research. They can be used to study for example gene expression, protein localization or complex cell physiological processes. The largest class of fluorescent proteins is formed by the GFP-family with its numerous variants derived from proteins found in the jellyfish A. victoria and various Anthozoa species. FMN-binding fluorescent proteins (FbFPs), which were developed in recent years from blue light sensing LOV-domains found in plants and many bacteria, form another class of fluorescent proteins that complements the toolkit of available fluorescent proteins due to their independence of molecular oxygen. In this work, novel FbFP variants which exhibit new and unique properties have been developed and characterized. The two existing proteins EcFbFP and Pp2FbFP have been improved by random and site-directed mutagenesis to yield variants with enhanced in vivo fluorescence, blue shifted spectra and – in case of Pp2FbFP – an increased fluorescence quantum yield. To yield FbFPs with red shifted emission spectra, all available FbFPs were screened for the ability to bind the Flavin analog roseoflavin and produce a red shifted fluorescence signal. In these studies Pp1FbFP has been shown to efficiently bind RoFMN and to produce a bright fluorescence with an emission maximum of λ = 540 nm, which represents a significant red shift compared to FbFPs with FMN. The proteins ability to bind two different chromophores with dissimilar spectral characteristics renders it a promising candidate for the development of an FbFP-based secretion marker. In order to further expand the applicability of fluorescent proteins to the field of thermophilic organisms that often live under anaerobic conditions, a set of novel FbFPs has been developed from LOV-domains found in such thermophiles. With melting temperatures of > 75 °C, these proteins exhibit significantly higher thermostabilities than other FbFPs and should theoretically be stable enough for the application as fluorescent reporters in thermophilic organisms.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	06.01.2017
Dateien geändert am:	06.01.2017
Promotionsantrag am:	03.11.2014
Datum der Promotion:	19.01.2015