Dokument: Role of kindlin and talin in the fibrillogensis of fibronectin by platelet integrins exposed to fluid shear forces

Titel:	Role of kindlin and talin in the fibrillogensis of fibronectin by platelet integrins exposed to fluid shear forces
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36555
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160118-110322-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Nguyen, Thi Thu Huong [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.12.2015 / geändert 10.12.2015
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Diese Arbeit fokussiert sich auf die Rolle der Adapter-Proteine, Talin-1 und Kindlin-3, die die Integrine mit dem Zytoskelett verbinden und somit an der Fibrillogenese des Fibronektins unter flussdymanischen Scherkräften beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit war es notwendig neben dem Einfluss der Scherkräfte in der Flüssigkeit, auch die physikalischen Eigenschaften des eingesetzten rostfreien Stahls im Rheometer, der β3-Integrine und der Aktinpolymerization auf die Entfaltung des Fn zu untersuchen. Lösliches Plasmafibronektin (Fn) mit seiner inaktiven, kompakten Struktur muss in aktive, unlösliche Fib-rillen überführt werden, damit es seine Funktion in Hämostase und Thrombose einnehmen kann. Unlös-liche Fibrillen des Fn können mittels Deoxycholate präzipitiert und im Immunoblotting dargestellt wer-den, um so die Dynamik der Fn-Fibrillogenese unter Simulation venöser oder arterieller Flussbedingun-gen nachzuvollziehen. Die Ergebnisse belegen, dass physiologische und pathologische Scherraten (50 - 5000 s-1 ) die Konformation des Fn verändern wobei fibrilläre Strukturen entstehen, die eine gesteigerte Thrombozytenadhäsion vermitteln. Die Oberfläche rostfreien Stahls trägt zur Fn-Fibrillogenese bei. Als Antwort auf Agonisten (z.B. ADP) durchlaufen vormals nicht aktivierte, niedrig ligand-affine Integrine eine funktionsrelevante Konformationsänderung, wobei sich die Affinität zum Liganden (z.B. für Fibrino-gen oder Fn) erhöht. Die Beteiligung der thrombozytären Integrine αIIβ3, αvβ3 und α5β1 an der Fn-Fib-rillogenese wurde mittels ADP und unter Einsatz inhibitorischer Antikörper untersucht. Die Ergebnisse beweisen, dass das Integrin αIIβ3 in der Fibrillenbildung dominiert, während dem Integrin α5β1 eine Ne-benrolle zukommt. Die Aktinpolymerisation nimmt ebenfalls eine entscheidende Rolle ein, da ihre Blo-ckade das Entfalten und Fibrillogenese des Fn hemmt. Zusammengefasst legen die Beobachtungen den Schluss nahe, dass die Wechselwirkung zwischen Fn und dem Integrin αIIβ3 bzw. Integrin αIIβ3 und dem Zytoskelett für die Fibrillogenese einer plasmatischen Fn-Matrix von entscheidender Bedeutung sind. Es ist bekannt, dass der zytoplasmische Schwanz der β3-Untereinheit mit einer Reihe von Proteinen der Signalwege und des Zytoskeletts – einschließlich Talin und Kindlin - interagiert. Der Verlust dieser β3-In-teraktion mit diesen regulatorischen Proteinen verursacht Defekte in der Signalübermittlung. In dieser Arbeit wurden daher, abgeleitet von der Sequenz des zytoplasmatischen Schwanzes der β3-Untereinheit, mimetische Peptide eingesetzt, die an Talin-1 bzw. Kindlin-3 binden, um auf diesem Weg die Strukturen und Funktionen zwischen den Bindungspartnern - β3-Untereinheit und Adapter-Proteinen - aufheben. Die Ergebnisse legen dar, dass die mimetischen Peptide in den Thrombozyten eindringen und im Zyto-plasma spezifisch an ihre Adapter-Proteine binden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass β3-mimeti-sche Peptide die Thrombozytenadhäsion, -aggregation und die Aktivierung des Intergins αIIbβ3 beein-trächtigt und daraus resultierend eine Verminderung der scherkraft-induzierten Fibrillogenese des Fn vermitteln. This work focused on the roles of adaptor proteins Talin-1 and Kindlin-3, which connect integrins with the cytoskeleton, in modulating Fn fibrillogenesis induced by flow-simulated shear forces. In this context, it was necessary to characterize the effect of fluid shear forces, physical properties of stainless steel of the rheometer, β3 integrins, and actin polymerization on the Fn unfolding. Soluble plasma fibronectin (Fn) with its inactive compact structure requires unfolding to assemble into active fibrils, which play a role in hemostasis and thrombosis. Hence, deoxycholate solubility assay and Western blot were used as a tool to monitor Fn fibrillogenesis induced by dynamic shear simulating venous or arterial flow conditions. The presented data show that flow and resulting shear stress over a broad range of physiological and pathological rates (50 – 5000 s-1) could induce conformational changes of plasma Fn. These Fn fibrils could support platelet adhesion. In addition, physical properties of metallic material modulate Fn fibrillogenesis. Upon stimulation with agonists (e.g., ADP), integrins expressed in a low affinity state undergo conformational changes that results in increased affinity for their ligands (i.e., Fn, fibrinogen). Platelet integrins (αIIbβ3, αvβ3, and α5β1) were blocked by inhibitory antibodies to determine their contribution to shear-induced Fn fibrillogenesis. Hereby, αIIbβ3 plays a predominant role, while α5β1 has a minor part in terms of fibril formation. The dynamic of actin polymerization is also necessary for fibril formation of Fn. Disruption of the actin polymerization markedly diminished Fn unfolding and assembly. These observations lead to the conclusion that Fn-integrin αIIbβ3-cytoskeleton interaction is crucial for the assembly of plasma Fn matrix under flow conditions. The cytoplasmic tail of integrin β subunit has been shown to interact with many signaling and cytoskeletal proteins, including Talin and Kindlin. A loss of β3 interactions with these intracellular adaptor proteins could cause defective signaling. Two β3 cytoplasmic tail mimetic peptides were used to abrogate the structure and functional link between the β cytoplasmic tail and adaptor protein, Talin-1 or Kindlin-3, in platelets. Data showed that these integrin mimetic peptides could penetrate into platelet cytoplasm and bind specifically to their adaptor proteins. In addition, it is demonstrated that β3 mimetic peptides could impair platelet adhesion, platelet aggregation and integrin αIIbβ3 activation, resulting a reduction in Fn fibrillogenesis induced by shear.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Hämostaseologie und Transfusionsmedizin
Dokument erstellt am:	18.01.2016
Dateien geändert am:	18.01.2016
Promotionsantrag am:	26.05.2015
Datum der Promotion:	21.10.2015