Dokument: Untersuchungen zur Induktion respiratorischer Hyperreaktionen mittels organoider in vitro Kulturen im Vergleich zur Situation in vivo

Titel:	Untersuchungen zur Induktion respiratorischer Hyperreaktionen mittels organoider in vitro Kulturen im Vergleich zur Situation in vivo
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36500
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160128-102939-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stahl, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,71 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.12.2015 / geändert 04.12.2015
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die eigentliche Aufgabe des Immunsystems liegt im Schutz des Körpers vor Pathogenen, wie Viren, Bakterien, Parasiten oder auch Toxinen. Fehlregulationen können zu einer Immunantwort auf ein eigentlich harmloses Antigen führen und so unter Umständen die Entstehung einer Hyperreaktion auslösen. Aus der eigentlich den Körper vor Pathogenen schützenden Immunantwort wird dann eine Reaktion mit schädlicher Wirkung. Hyperreaktionen können an allen Körperoberflächen, an denen Antigene aufgenommen werden, wie Haut, Darm oder Atemwege, entstehen. Respiratorische Hypersensitivitätsreaktionen betreffen die oberen und unteren Atemwege. Sie sind weit verbreitet und manifestieren sich beispielsweise in Form von allergischer Rhinitis oder Asthma. Einige Substanzen begünstigen die Entstehung solcher Hypersensitivitätsreaktionen. Für die Identifizierung dieser fehlt es derzeit sowohl in vivo als auch in vitro noch an akzeptierten und validierten Testmethoden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst in einem in vivo Kurzzeitmodell mit intratrachealer Applikation an Ratten das sensibilisierende Potential des Proteins KLH (keyhole limpet hemocyanin) untersucht und dabei die Produkte zweier Hersteller verglichen. Nach Induktion und Challenge zeigten sich anhand von Parametern in den drainierenden Lymphknoten und der broncholveolären Lavage durch beide KLH-Präparationen deutliche Effekte einer TH2-basierten Immunantwort, welche darauf hinweisen, dass KLH ein respiratorisch sensibilisierendes Potential besitzt. Ausgehend von den in vivo gewonnenen Ergebnissen wurde anhand von organoiden in vitro Kulturen die Induktionsphase der Hyperreaktion weiter untersucht. Präzisionslungenschnitte (PCLS) aus der Ratte kamen bisher hauptsächlich in Zytotoxizitätsassays und in Untersuchungen zur Reaktion der Lunge auf inflammatorische Stimuli zum Einsatz, da sie in ihrer dreidimensionalen Struktur einen Querschnitt aller in der Lunge vorhandenen Zellen enthalten. In dieser Arbeit wurde die Expression relevanter Zytokine sowie die Signaltransduktion unter anderem als Reaktion auf die Stimulation mit den sensibilisierenden Substanzen DNCB (1-Chlor-2,4-dinitrobenzol) und TMA (Trimellitsäureanhydrid) im Vergleich zu KLH untersucht. Die Präzisionslungenschnitte zeigten eine gute Stimulierbarkeit durch Endotoxin und Mitogen. Hinweise für die Induktion einer Hyperreaktion konnten dagegen nicht eindeutig detektiert werden. Auch die zusätzliche Aktivierung der antigenpräsentierenden Zellen oder eine ex vivo Restimulation nach Induktion in vivo zeigten nur Tendenzen und führten für KLH weder zu einer eindeutig verstärkten Zytokinsekretion, die Rückschlüsse auf eine Immunantwort zuließe, noch zu einer Phosphorylierung bestimmter Signalproteine, welche beispielsweise für Kontaktsensibilisierer in Hautmodellen nachgewiesen werden kann. In Kombination mit der zeitlich beschränkten Kulturdauer erwiesen sich die PCLS demnach als nur bedingt geeignet zur Untersuchung der Induktionsphase einer respiratorischen Hyperreaktion. Einen weiteren in vitro Ansatz bildete die Kokultur von antigenpräsentierenden Zellen und Lymphozyten im künstlichen Lymphknoten als 3D-Modell und in der 2D-Kokultur im Well, in der die Situation der Antigenpräsentation und Initiierung der Immunantwort im Lymphknoten abgebildet werden soll. Aus dem Knochenmark der Ratte generierte dendritische Zellen wurden nach spezifischer Reifung über einen Zeitraum von 14 Tagen mit Zellsuspensionen aus Milz und Lymphknoten der Ratte kultiviert. Die Restimulation mit Antigen am Tag 7 führte nur im künstlichen Lymphknoten zu einer KLH-induzierten Sekretion von zum Teil TH2-typischen Zytokinen, während in der 2D-Kokultur keine KLH-spezifische Reaktion induziert werden konnte. Die dreidimensionale Struktur scheint also ein elementarer Faktor zu sein. Nach Verifizierung der Art der entstehenden Immunantwort durch beispielsweise den Nachweis von KLH-spezifischen Antikörpern sowie einem Vergleich mit anderen sensibilisierenden Substanzen, könnte solch eine Kokultur die Möglichkeit zur Untersuchung der Induktionsphase einer respiratorischen Hyperreaktion bieten. Inwieweit eine Differenzierung zwischen Kontaktsensibilisierern und respiratorisch wirkenden Substanzen anhand eines solchen in vitro Assays möglich wird, bleibt allerdings zu klären. The immune systems major task is the protection against pathogens like viruses, bacteria, parasites or toxins. Malfunctioning in this complex system can lead to an immune response against an otherwise innocuous antigen and thereby provoke hypersensitivity reactions. Hypersensitivity reactions can occur on every surface of the body where antigens are absorbed, like the skin, the intestinal tract or the respiratory tract. Respiratory hypersensitivity reactions are a widespread health issue and can affect the upper as well as the lower respiratory tract with clinical manifestations such as allergic rhinitis or asthma. Certain substances can promote the development of hypersensitivity reactions, but accepted and validated methods are still missing at present. An in vivo short term model using intratracheal application in rats was established to test and compare the sensitizing potential of the protein KLH (keyhole limpet hemocyanin) by using products of two manufacturers. After induction and challenge, parameters in the draining lymph nodes and bronchoalveolar lavage were determined. Both KLH products provoked marked effects with tendencies of a TH2-based immune response which lead to the conclusion that KLH might be a potential respiratory sensitizer. Based on the results of the in vivo experiments, organoid in vitro cultures were used to further investigate the induction phase of the hypersensitivity reaction. Precision cut lung slices (PCLS) contain an average of the cells present in the lung, maintained in their original three-dimensional structure. The expression of relevant cytokines as well as signal transduction was analyzed after stimulation with several substances including the known sensitizers DNCB (2,4-Dinitrochlorbenzene) and TMA (trimellitic anhydride) in comparison to KLH. PCLS could be stimulated by endotoxin and mitogen but evidence of the induction of hypersensitivity reactions could not be detected. Concerning KLH additional activation of antigen-presenting cells or ex vivo restimulation after in vivo induction showed only little effects on cytokine secretion. Also signal transduction, which is affected in skin models after treatment with contact sensitizers, did not show specific alterations after treatment with KLH. Therefore, and regarding the relatively short cultivation period, PCLS appear to be of limited suitability for investigations of the induction phase of respiratory hypersensitivity reactions. The second in vitro approach was the co-cultivation of antigen-presenting cells with lymphocytes in the three-dimensional structure of an artificial lymph node and on a two-dimensional level in well-plates, representing the antigen presentation and initiation of an immune response in the lymph node. After antigen-specific maturation, bone marrow-derived dendritic cells were cultivated with rat cells from lymph nodes and spleens for 14 days. In the artificial lymph node restimulation with antigen on day 7 lead to a secretion of cytokines which were in part typical for a TH2-based reaction, while no KLH-specific response could be provoked in 2D co-culture. Therefore the three-dimensional structure might be a critical factor. The results gained show, that after further verification of the nature of the developing immune response by measuring KLH-specific antibodies for example and comparison with other sensitizing substances, such a co-culture might become a useful tool for investigations of the induction of respiratory hypersensitivity reactions. Whether a differentiation between contact sensitizers and respiratory sensitizers can be reached using this in vitro assay remains to be seen.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	28.01.2016
Dateien geändert am:	28.01.2016
Promotionsantrag am:	26.03.2015
Datum der Promotion:	29.10.2015