Dokument: Evaluierung eines Rhodobacter capsulatus nif Promotor-basierten Systems für die heterologe Expression von therapeutisch relevanten Membranproteinen

Titel:	Evaluierung eines Rhodobacter capsulatus nif Promotor-basierten Systems für die heterologe Expression von therapeutisch relevanten Membranproteinen
Weiterer Titel:	Evaluation of a Rhodobacter capsulatus nif promoter-based system for the heterologous expression of therapeutically relevant membrane proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36499
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20151207-084403-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Özgür, Armagan Yakup [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,09 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.12.2015 / geändert 04.12.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Expressionssystem, Membranprotein, Rhodobacter, Nif, heterologe Expression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die biotechnologische Produktion von Membranproteinen mit Hilfe von gentechnisch veränderten Organismen nimmt eine zentrale Rolle für die medizinische und pharmakologische Forschung ein. 50 % - 70 % aller auf dem Markt erhältlichen Medikamente sind direkt oder indirekt gegen Membranproteine gerichtet. Trotz großer Nachfrage fehlen immer noch fundamentale Informationen über die Struktur und Funktion dieser Proteine. Viele bekannte Expressionssysteme und Expressionswirte wie z.B. E. coli sind für die Produktion von löslichen Proteinen, nicht jedoch für die heterologe Expression von Membranproteinen optimiert. Aus diesem Grund ist es wichtig, nicht nur alternative Expressionssysteme zu erforschen, sondern auch alternative Expressionswirte, die aufgrund ihrer speziellen Physiologie natürlicherweise an die Produktion von Membranproteinen adaptiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das fakultativ phototrophe Bakterium Rhodobacter capsulatus für die heterologe Expression von therapeutisch relevanten Membranproteinen evaluiert. Hierzu wurde zunächst ein neuer Expressionsvektor (pRhonHi-2) basierend auf dem wirtseigenen nifHDK Promoter konstruiert. Expressionsstudien mit einem Reportergen haben gezeigt, dass die Expression des Zielgens unter der Kontrolle des nifHDK Promotors sehr strikt und einfach über die verwendete Stickstoffquelle im Kultivierungsmedium gesteuert werden kann. Ferner konnte durch Verwendung von alternativen Kultivierungsgefäßen und einer Deletionsmutante die Expression gesteigert werden, so dass eine ideale Basis für die effiziente Evaluierung des Bakteriums geschaffen wurde. Für die Evaluierung wurden 10 therapeutisch relevante Membranproteine, die alle unterschiedliche physiologische Funktionen und Topologien aufweisen, vergleichend in R. capsulatus und der etablierten mikrobiologischen Plattform Escherichia coli exprimiert. Hierbei wurde die heterologe Expression in R. capsulatus unter Berücksichtigung folgender Paramater evaluiert: i) verwendeter Promoter ii) Expressionsdauer iii) verwendeter R. capsulatus Stamm. Die vergleichende Expressionsstudie hat ergeben, dass die erfolgreiche Insertion von Proteinen in die Membran von R. capsulatus von all diesen Faktoren abhängt. Ferner konnten die Ergebnisse aufzeigen, dass Membranproteine mit einer hohen Anzahl an Transmembrandomänen in höheren Mengen in der Membran von R. capsulatus akkumulierten, wohingegen Membranproteine mit einer geringen Anzahl an Transmembrandomänen vergleichbar oder effizienter in die Membran von E. coli BL21 (DE3) inseriert werden konnten. In nachfolgenden Studien konnte das neue Expressionssystem durch Veränderung der Kultivierungsbedingungen hinsichtlich der Beleuchtung und des verwendeten Kultivierungsmediums weiter optimiert werden. Abschließend konnte die Anwendbarkeit von R. capsulatus für die Herstellung von korrekt gefalteten Membranproteinen am Beispiel der Protonenpumpe Bakteriorhodopsin gezeigt werden. The biotechnological production of membrane proteins by genetically modified organisms plays a pivotal role for medical and pharmaceutical research. Around 50 % - 70 % of all available drugs on the market are either directly or indirectly targeting membrane proteins. Despite this huge interest in this protein class, there is still fundamental knowledge lacking about the structure and function of these proteins. Common expression systems and common expression hosts such as E. coli are optimized for the production of soluble proteins, but not for the heterologous expression of membrane proteins. For this reason, apart from exploring new expression systems it is important to exploit alternative expression hosts, which are naturally adapted to produce membrane proteins due to their specialized physiology. The presented thesis was concerned with the evaluation of the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus for the heterologous expression of therapeutically relevant membrane proteins. To this end, a new expression vector (pRhonHi-2) based on the host specific nifHDK promoter was first constructed. Expression studies conducted with the help of a reporter gene illustrated that genes placed under the control of the nifHDK promoter can easily and very strictly be regulated by the nitrogen source in the cultivation medium. Furthermore, deploying alternative cultivation vessels as well as a deletion mutant could improve pRhonHi-2 mediated target gene expression significantly, so that an ideal basis for the efficient evaluation of the bacterium was established. For the actual evaluation, 10 therapeutically relevant membrane proteins characterized by different topologies and physiological functions were comparatively expressed in R. capsulatus and the established platform organism Escherichia coli. The evaluation of R. capsulatus was conducted under consideration of the following parameters: i) the employed promoter ii) the expression duration iii) the employed R. capsulatus strain. The comparative expression analysis illustrated that successful insertion of proteins into the membrane of an expression host is affected by all these factors. Furthermore, the results led to the conclusion that membrane proteins exhibiting a higher number of transmembrane domains were accumulated at higher levels in the membrane of R. capsulatus, whereas membrane proteins exhibiting a lower number of transmembrane domains illustrated equal or better membrane insertion in the expression host E. coli BL21 (DE3). Subsequent experiments could further improve the new expression system by alteration of cultivation conditions with regard to illumination and medium composition. Finally, the applicability of R. capsulatus for the production of correctly folded membrane proteins could be verified using the example of the proton pump bacteriorhodopsin.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	07.12.2015
Dateien geändert am:	07.12.2015
Promotionsantrag am:	05.05.2015
Datum der Promotion:	18.06.2015