Dokument: GABARAPs vermitteln den anterograden Transport und die Sekretion von HIV-1 Nef durch Autophagie-basierte unkonventionelle Sekretionsmechanismen

Titel:	GABARAPs vermitteln den anterograden Transport und die Sekretion von HIV-1 Nef durch Autophagie-basierte unkonventionelle Sekretionsmechanismen
Weiterer Titel:	GABARAPs mediate the anterograde transport and secretion of HIV-1 Nef via autophagy-based unconventional secretion
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36449
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20151204-094708-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Boeske, Alexandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,01 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.11.2015 / geändert 30.11.2015
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Aufgrund seiner vielfachen Funktionen wird das Nef-Protein als wichtigster Pathogenesefaktor für die Entwicklung der bei einer HIV-1-Infektion erworbenen Immundefizienz (AIDS) angesehen. Eine Infektion mit einem Nef-defizienten Virenstamm führt zu deutlich schwächeren Symptomen in HIV-infizierten Patienten. Die Expression des viralen Nef-Proteins induziert nicht nur eine massive Sekretion extrazellulärer Vesikel in mit HIV 1 infizierten oder Nef-transfizierten Zellen, sondern auch die Sekretion von Nef selbst. Mittlerweile wird vermutet, dass diesen Sekretionsvorgängen eine entscheidende Rolle bei der Etablierung der erworbenen Immundefizienz zukommt. Zusätzlich ist für die meisten bisher beschriebenen Effekte, die Nef in der Zelle auslöst, dessen anterograder Transport zur Plasmamembran obligatorisch. Das Ziel dieser Arbeit ist die detaillierte Charakterisierung der Interaktion zwischen HIV-1 Nef und den Mitgliedern der GABARAP/GABARAPL2-Familie (GABARAPs) der humanen ATG8s, die im Rahmen eines Hefe-Zwei-Hybridsystems gefunden wurde. Dabei sollte im Rahmen dieser Arbeit besonders die biologische Relevanz der Bindung untersucht werden. In dieser Arbeit konnte die Assoziation und die Bindung zwischen Nef und den GABARAPs mit Hilfe von Koimmunopräzipitationen aus Zellysaten und Pull-Down Analysen mit rekombinant exprimiert und gereinigten Proteinen nachgewiesen werden. Dabei wird die Spezifität der Bindung durch die beiden Aminosäurereste S53 und F62 im GABARAP-Molekül vermittelt. Mittels Sequenzanalyse konnte ein potentielles GIR (GABARAP/GABARAPL2 interaction region) -Motiv im N-terminalen Bereich von Nef identifiziert werden. Eine Mutation, des an der Interaktion beteiligten W13 von Nef, unterdrückte die die Nef-Bindung an GABARAP. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz entsprechender siRNA-Pools nicht nur eine Plasmamembranständigkeit von Nef verloren, sondern auch dessen Sekretion unterbunden wird. Aufgrund der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse, konnte ein Modell entwickelt werden, welches beschreibt, wie Nef nicht nur zur Plasmamembran transportiert werden, sondern auch wie seine Sekretion über unkonventionelle Sekretionswege ablaufen könnte. Nach diesem Modell kämen zwei, strikt GABARAP-abhängige, Sekretionswege in Frage: ein auf Autophagie-basierender und LC3B-anhängiger Weg sowie ein Weg bei dem der anterograde Transport und die Sekretion von Nef unabhängig von LC3s über die Ausbildung sogenannter CUPS (compartments of unconventional protein secretion), davon abgeschnürter Vesikel und deren Internalisierung in multivesikulären Körpern (MVBs) erfolgt. HIV-1 accessory protein Nef is responsible for many pathogenic effects during acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) progression because lack of intact Nef attenuates the symptoms in HIV infected patients. Expression of the viral protein Nef induces extensive secretory activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infected or Nef transfected cells including its own secretion. Nef mediated secretion is suggested to explain the detrimental effect on bystander cells observed in HIV infection. In addition, anterograde transport of Nef towards the plasma membrane (PM) is thought to be obligatory for most of the cardinal Nef functions in infected cells. The aim of this work was the more detailed characterization of the selective binding between HIV-1 Nef and members of the GABARAP/GABARAPL2 subfamily (GABARAPs) of human ATG8s, recently identified during Y2H screen und preliminary described in vitro in our lab. During this work, major focus was put on the elucidation of putative biological consequences of the interaction of Nef with GABARAPs host factors in mammalian cells. In this thesis association and direct binding between Nef and GABARAPs was confirmed by their coimmunoprecipitation from cell lysates and by pull-down analysis using recombinant protein samples, respectively. Thereby, GABARAP residues S53 und F62 confer specificity. Mutational analysis revealed that in Nef a GIR (GABARAP/GABARAPL2 interacting region) motif located in its flexible N-terminal domain surrounding W13 is crucial for this interaction. RNA interference revealed that secretion of Nef requires the expression of at least one of the GABARAPs, whereas LC3s are not essential for this process. GABARAPs silencing also impaired Nef’s PM localization. On the basis of the results obtained in this work, a model was provided that describes not only Nef’s transport to the PM but also how it could be secreted via unconventional secretion. Based on the model two pathways that are strictly depending on GABARAP are assumed: One adapted from autophagy and LC3s and one other pathway, which is LC3 independent. During the second pathway Nef’s anterograde transport and secretion relies on the formation of compartments of unconventional secretion (CUPS), CUPS-derived vesicles and the internalization of this vesicles in multicesicular bodies (MVBs).
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » NMR - Spektroskopie biologischer Makromoleküle
Dokument erstellt am:	04.12.2015
Dateien geändert am:	04.12.2015
Promotionsantrag am:	18.11.2014
Datum der Promotion:	09.12.2014