| Beschreibungen: | Genetische Diversität einzelner Tumorzellen trägt wesentlich zu der Komplexität der Krebserkrankung bei und stellt eine große Herausforderungen für die Molekular- Diagnostik und -Therapie dar. Ziel dieser Arbeit war bei bekannter Heterogenität, auf Ebene von SCNAs von Einzelzellen des Kopf-Hals-Karzinoms, metastasierungsrelevante Kandidatengene herauszufiltern, die auch als therapeutische Zielstruktur dienen könnten. Hierfür wurden Zellsuspensionen aus frischen Gewebeproben hergestellt und einzelne Tumorzellen nach einer Doppel-Immunfluoreszenzfärbung gegen CD44v6, CK5 und CK14 identifiziert. Anschließend wurden Marker-positive Zellen mithilfe des Fluoreszenz-aktivierten-Zell-Sorting (FACS) oder der Mikromanipulation isoliert. Das Genom der isolierten Einzelzellen wurde über eine Adapter-Linker-PCR amplifiziert und mithilfe der Array basierten Comparativen-Genomischen-Hybridisierungs-Technik (aCGH, 4_x_180k) wurden SCNA-Profile erstellt. Insgesamt konnten für 82 Tumorzellen von fünf Patienten SCNA-Profile ausgewertet werden. Interessanterweise zeigte jede der analysierten Tumorzellen individuelle genetische Veränderungen neben den gemeinsamen Veränderungen. Auffallend war, dass die Zellen der Metastasen einen niedrigeren Grad an Heterogenität im Vergleich zu den Zellen aus autologen Primärtumoren aufwiesen. Darüber hinaus konnte in den Metastasen im Vergleich zu den Primärtumoren die Region 8q24 als signifikant häufiger zugewonnen identifiziert werden. Mit Hilfe der Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH), konnte dieser Zugewinn anhand des in 8q24 lokalisierten Gene MYC, in einem Kollektiv von 28 HNSCC Primärtumor/Metastasen-Paaren, bestätigt werden. Um die Relevanz des 8q24-Zugewinns in den Metastasen zu überprüfen, wurden die Expressionsprofile der in 8q24 lokalisierten Gene in 13 Primärtumor/Metastasen-Paaren analysiert. Dadurch konnten zehn Gene, einschließlich ASAP1, identifiziert werden, deren Überexpression mit dem in der aCGH detektierten 8q24-Zugewinn übereinstimmen. Darüber hinaus konnte für ASAP1 eine Bedeutung für die Zellmigration von Kopf-Hals Tumorzellen in einem in vitro Migrationsassays festgestellt werden.Genetic variation of single tumor cells contributes significantly to the complexity of cancer and imposes significant challenges for therapy and molecular diagnostics. The aim of this study was to identify potentially therapeutic targets within the known genetic heterogeneity of HNSCC by SCNA-profiling of single cells. Cellular suspensions were generated from fresh biopsy specimens and single epithelial tumor cells were isolated by fluorescence-activated-cell-sorting (FACS) or micromanipulation after double-immunofluorescence staining against CD44v6, CK5, and CK14. The whole genome of isolated single cells was amplified via an adapter-linker-PCR and subsequently analyzed for SCNA by array comparative genomic hybridization (aCGH, 4 x 180k). In total, 82 informative genetic profiles from single tumor cells from five different patients could be obtained. Notably, it was observed that each analyzed tumor cell presented unique as well as common aberrations. Beyond that, metastases displayed a lower degree of heterogeneity at the single cell level compared to matched primary tumors. Further, it was possible to identify the region 8q24 as being significantly more affected by chromosomal gains in metastatic cells. This observation could be confirmed by fluorescence in-situ hybridization (FISH) for the MYC-locus in 28 additional HNSCC patient-matched pairs of primary tumors and metastases samples. In order to better understand the relevance of 8q24 for metastasis, the expression of all genes coded by that region using mRNA-expression microarrays in 13 primary tumor/metastasis pairs was analyzed. Thereby, ten genes could be identified, which expression correspond positively with the amplification status of 8q24, including ASAP1. Using an in vitro migration assays it could be demonstrated that ASAP1 has a relevance for cellular migration.
|
