Dokument:
The Inducible Nitric Oxide Synthase Exerts Antioxidant Effects in Endothelial Cells via a Zinc-Dependent Signaling Pathway
[Die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase
induziert endotheliale Resistenz gegen oxidativen Stress
über einen zinkabhängigen Signalweg ]
| Titel: | The Inducible Nitric Oxide Synthase Exerts Antioxidant Effects in Endothelial Cells via a Zinc-Dependent Signaling Pathway [Die induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase induziert endotheliale Resistenz gegen oxidativen Stress über einen zinkabhängigen Signalweg ] | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3633 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20070227-140155-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Cortese, Miriam Margherita [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Kolb-Bachofen, Victoria [Gutachter] Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Fösterman, Ulrich [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Zink, Stickstoffmonoxid, NO, iNOS, Endothelzellen, oxidativen Stress, Endotjelialdysfunction, Glutathione, GSHZinc, NO | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Entzündung, oxidativer Stress und Lipid-Stoffwechselstörungen gelten als Hauptursachen für die endotheliale Dysfunktion und für die Initiation der Arteriosklerose. Während eines entzündlichen Stimulus können Endothelzellen den indizierbaren Isotyp der NO-Synthasen (iNOS) exprimieren und so über einen längeren Zeitraum relativ hohe Konzentrationen an Stickstoffmonoxid (NO) produzieren (high-output Synthese). In der vorliegenden Arbeit wurde eine 24-stündige Inkubation von Endothelzellkulturen mit H2O2 als Modell für den oxidativen Stress gewählt. In diesem Modell konnte bestätigt werden, dass der Peroxid-induzierte Zelltod vollständig aufgehoben wurde in Anwesenheit eines exogen zugegebenen NO-Donormoleküls oder alternativ durch die endogene high-output NO-Synthese über die iNOS. Dieser NO-vermittelte Schutz wird durch Blockade der de novo Proteinsynthese völlig aufgehoben. Somit wird die protektive Wirkung von NO über eine Transkriptionsregulation vermittelt. Hier konnte gezeigt werden, dass das GSH-System eine zentrale Rolle im NO-vermittelten Schutz darstellt. Die Inhibition der GSH-Peroxidase, aber nicht der Katalase, hebt die Schutzwirkung von NO auf. Es zeigte sich, dass NO die Expression der Glutamat-Cystein Ligase (GCL) induziert, die den geschwindigkeitslimitierenden Schritt der GSH-Synthese katalysiert. Die erhöhte Expression der GCL resultiert in einem signifikant erhöhten intrazellulären GSH-Spiegel. Eine Inhibition der GCL hebt den NO-vermittelten Schutz auf. Die zellulären GSH-Spiegel korrelieren signifikant und direkt mit dem Überleben der Zellen nach der Peroxyd-Behandlung. Daraus lässt sich schließen, dass die antioxidative Wirkung von NO hauptsächlich auf der Erhöhung der Transkription der GCL und damit der GSH-Konzentration in der Zelle beruht. Es ist bekannt, dass die high-output NO-Synthese die Labilisierung von Zink aus Zink-Schwefel-Clustern über S-Nitrosierung bewirkt. Da Zink ein bekannter transkriptioneller Regulator mit einer antioxidativen Wirkung ist, wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine NO-induzierte Zink-Umverteilung den molekularen Mechanismus darstellt, der zum Zellschutz vor oxidativem Stress führt. Dies würde einen neuen Signaltransduktionsweg darstellen. Es konnte gezeigt werden, dass durch Zinksupplementation gleiche Effekte wie mit NO erzielt werden, die sich aber in ihrer Kinetik unterscheiden, nämlich eine Erhöhung der GCL-Expression, der zellulären GSH-Spiegel und des Zellschutzes. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit herausgefunden, dass Zink-Defizienz, erreicht durch einen Zink-spezifischen Chelator (TPEN), zur Aufhebung der NO-induzierten Effekte also der Erhöhung der GCL -Expression, der Erhöhung der GSH-Spiegel und dem Schutz vor Peroxyd führt. Daraus lässt sich schließen, dass die iNOS-vermittelte NO Synthese Endothelzellen hauptsächlich über eine zinkabhängige Verstärkung der Gclc-Gentranskription schützt. In dieser Arbeit wurde auch nach der Beteiligung von spezifischen Transkriptionsfaktoren, insbesondere als Zielmoleküle für die NO-induzierte Zink-Labilisierung, gesucht. Mit den Methoden der RNA-Interferenz und der konfokalen Lichtmikroskopie konnte gezeigt werden, dass NO die Expression des Gclc-Gens über eine zinkabhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 induziert. Des Weiteren konnte auch festgestellt werden, dass NO die Expression von Zielgenen für MTF-1 zinkabhängig induziert. Dies zeigt, dass NO sowohl Nrf2 als auch MTF-1 über eine Zinklabilisierung aktiviert. Zusätzlich wurden auch Hinweise auf eine Regulation der NFκB-Aktivierung gefunden. Es ist bekannt, dass NFkB die iNOS-Expression reguliert und dass die NFκB-Aktivität durch Zink inhibiert wird. Hier konnte gezeigt werden, dass eine zusätzliche Gabe von Zink unter proinflammatorischen Bedingungen die iNOS-Promotoraktivität, -Expression und NO-Synthese reduziert. Dies deutet auf eine zinkvermittelte Inhibition der NFκB-Aktivität und damit auf einen feedback Regulationszyklus hin, der die endotheliale Aktivierung limitiert. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Induktion einer lang andauernden endogenen, antioxidativen Schutzreaktion, über die Erhöhung der intrazellulären GSH-Spiegel, einen wesentlichen Weg darstellt, über den NO oxidative Schäden vermindert und vor endothelialem Zelltod schützt. Weiterhin demonstrieren die hier erzielten Ergebnisse, dass intrazellulär labilisiertes Zink als Botenstoff in einer neuen NO-vermittelten Signalkaskade wesentlich ist. Die Aufdeckung von Interaktionen zwischen den zentralen Faktoren der Entzündungsreaktion, insbesondere des Zusammenspiels von iNOS-vermittelter NO-Synthese und Zink, sollen helfen die Mechanismen zu verstehen, die zu endothelialer Dysfunktion und zu chronisch-entzündlichen Prozessen führen.Inflammation, oxidative stress, and dyslipidemia have been indicated as main causes of endothelial dysfunction and thus of the onset of the atherosclerotic process. Under pro-inflammatory conditions, endothelial cells express the inducible form of nitric oxide synthase (iNOS), which produces high output synthesis of nitric oxide (NO). Using a 24-hour treatment with H2O2 as a model for oxidative stress, the present study confirms that peroxide-induced endothelial cell death can be completely inhibited by exogenously applied NO or iNOS-derived NO. The presence of a protein synthesis inhibitor blocks the NO-mediated protection, indicating that NO exerts its protective activity via transcriptional regulation. This study shows that the glutathione (GSH) system plays a central role in NO-mediated antioxidant activity. In fact, the inhibition of GSH peroxidase, but not of catalase, fully blocks the NO-mediated protective activity. NO induces the expression of glutamate-cysteine ligase (GCL), the enzyme catalysing the rate limiting step of the de novo synthesis of GSH. This increase in GCL enzyme levels produces an increase of total GSH. The inhibition of GCL fully abrogates the NO-mediated cytoprotection. Moreover, the GSH levels of the cells significantly and directly correlate with the rate of cell survival after the peroxide treatment. Therefore, the antioxidant activity of NO depends mainly on the transcriptional increase of GCL and on the increase of the GSH levels in the cells. It has been previously shown that high-output NO-synthesis induces zinc release from zinc-sulfur clusters via S-nitrosation. Since a signalling role of zinc has been demonstrated, the NO-mediated zinc redistribution might be a novel mechanism of signal transduction, leading to cellular protection against oxidative stress. The present study shows that in endothelial cells, zinc supplementation produces effects similar to NO. For instance, an increase in GCL expression, in total GSH cellular content, and in cell viability is observed. In addition, zinc deficiency, achieved by adding the cell-permeable zinc chelator TPEN, fully inhibits the NO-mediated protection against oxidative stress. Therefore the data presented here show that iNOS-derived NO protects endothelial cells against oxidative stress mainly via activating the transcription of Gclc in a zinc-dependent fashion. In addition, the involvement of specific transcription factors in NO-mediated protection, and particularly as targets of NO-mediated zinc redistribution, was also investigated here. Findings obtained by RNA interference and confocal microscopy demonstrate that NO induces the expression of Gclc by activating the transcription factor Nrf2. Moreover, the present study also shows that NO induces the expression of MTF-1 target genes in a zinc-dependent fashion, proving that both Nrf2 and MTF-1 are targets of NO-mediated zinc redistribution. An additional target of the NO-mediated zinc redistribution might be the transcription factor NFB, as proposed here. It is well known that zinc inhibits the binding and activation of NFB. In this study, it has been shown that under pro-inflammatory conditions zinc supplementation reduces the iNOS promoter activity, iNOS expression, and NO production. Since NFB is the main regulator of iNOS expression, the zinc-mediated inhibition of NFB might be a sort of feedback mechanism that limits endothelial activation. To conclude, the present study shows that the induction of long-term endogenous antioxidant defense mechanisms, and particularly the GSH system, may represent the major pathway by which NO limits oxidative injury and prevents endothelial cell death. Moreover, the data presented here clearly show that intracellular labile zinc is involved in the antioxidant activity of NO, pointing to a role of zinc as second-messenger in a novel NO-induced signaling pathway. Uncovering the interactions between the central players of inflammatory pathways, such as iNOS-derived NO and zinc contributes to understanding the mechanisms leading to endothelial dysfunction and chronic inflammatory conditions. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.01.2007 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.01.2007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 26.01.2007 |
