Dokument: A fluorescence microscopy based immunoassay for the specific detection and quantitation of alpha-synuclein aggregates

Titel:	A fluorescence microscopy based immunoassay for the specific detection and quantitation of alpha-synuclein aggregates
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=36290
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20151117-105122-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Hübinger, Steffen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.11.2015 / geändert 17.11.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Schnitzler, Alfons [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Synucleinopathies are a group of neurodegenerative disorders all characterised by the aggregation of misfolded α-synuclein. The symptoms, caused by neuronal cell death, range from motor skill impairment and dementia to psychological deficiencies and sleep disorders. These symptoms, which usually first appear years after disease onset, are the basis for clinical diagnosis. However, due to their late onset and a significant overlap of symptoms among synucleinopathies and also other neurodegenerative diseases, diagnosis is often complicated. Therefore, the search for a biomarker which can assist the diagnosis is of great importance to advance knowledge of the disease and reveal possible treatments. α-synuclein is a potential candidate for such a biomarker. Its aggregated state is a common biochemical feature of synucleinopathies and growing evidence suggests that its level decreases in CSF with disease progression. In this work, sFIDA was developed for the detection of α-synuclein exclusively in its aggregated state. First, the expression and purification of α-synuclein in high amounts and of high purity was established. Subsequently, different aggregation assays were compared and the biophysical properties of the aggregates were measured. CD spectroscopy, amyloid-specific ThT fluorescence and AFM imaging confirmed the formation of amyloid fibrils, which were used to establish sFIDA. Different conditions for storing the fibrils were tested and evaluated by analysing change in fibril content by absorption spectroscopy as well as change in fibril morphology by AFM. Antibodies to be used in sFIDA were fluorescently labelled. SPR measurements proved that labelling did not interfere with the ability of the antibodies to bind α-synuclein fibrils. Testing different combinations of antibodies for sFIDA revealed that the choice of the capture antibody is critical, as a dependence of signal strength on protein content of samples could only be achieved with antibody 211 as the capture. Variation in the choice of detection antibodies did not show a significant influence on measurements. After the adaptation of sFIDA for α-synuclein was accomplished, measurements showed that it was selective for the detection of aggregates and not monomers with a sensitivity of at least 1 pg/mL. Detection of recombinant aggregates in CSF in a concentration dependent manner was also shown. Analysis of CSF samples from patients with MSA and PD showed that the assay must still be optimised, but variation of antibodies and improved evaluation can easily be implemented and show great potential to increase sensitivity and specificity of the assay. Synukleinopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Krankheiten die alle durch die Aggregation von fehlgefaltenem α-Synuklein charakterisiert werden. Die durch den Tod neuronaler Zellen ausgelösten Symptome umfassen Bewegungsstörungen, Demenz, psychologische Beschwerden und Schlafstörungen. Diese Symptome, die oft erst Jahre nach dem eigentlichen Einsetzen der Krankheit auftreten, bilden die Grundlage der klinischen Diagnose. Aufgrund des späten Einsetzens der Symptome und den starken Überschneidungen der Symptome nicht nur innerhalb der Synukleinopathien selbst, sondern auch mit anderen neurodegenerativen Krankheiten, ist die Diagnose meist kompliziert. Deshalb ist die Suche nach einem Biomarker der die Diagnose unterstützt ausgesprochen wichtig um genauer Kenntnisse über den Verlauf der Krankheit und möglicher Therapien zu erhalten. α-Synuklein ist ein Kandidat für einen solchen Biomarker. Seine aggregierte Form ist das verbindende biochemische Merkmal der Synukleinopathien und es gibt vermehrt Belege dafür dass sich der α-Synukleingehalt im Krankheitsverlauf senkt. In dieser Arbeit wurde das sFIDA für die Detektion von α-Synukleinaggregaten entwickelt. Zuerst wurde die Aufreinigung von großen Mengen hochreinen α-Synukleins etabliert. Daraufhin wurden verschiedene Methoden zur Aggregation getestet und verglichen und anschließend die biophysikalischen Eigenschaften der Aggregate verglichen. Mittels CD-Spektroskopie, amyloid-spezifischer Fluoreszenz des Farbstoffs ThT und AFM wurde die Bildung amyloider Fibrillen bestätigt, welche im Anschluss zur Etablierung des sFIDA eingesetzt wurden. Unterschiedliche Lagerbedingungen der Fibrillen wurden getestet und anhand der Konzentrationsänderung und des Erscheinungsbildes der Fibrillen im AFM verglichen. Antikörper wurden zur Verwendung im sFIDA mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und SPR Messungen zeigten keine Beeinträchtigung der Bindung von Antikörpern an Fibrillen durch die Markierung. Das Austesten verschiedener Kombinationen von Antikörpern im sFIDA zeigte das eine Abhängigkeit des Signals von der Proteinmenge nur gegeben ist wenn Antikörper 211 als Capture eingesetzt wird, während die Kombination der Detektionsantikörper keinen großen Einfluss hat. Nach der erfolgreichen Anpassung des sFIDA an die Messung von α-Synuklein wurde gezeigt, dass selektiv Aggregate und nicht Monomere gemessen wurden, mit einer Sensitivität von mindestens 1 pg/mL. Die gilt auch wenn die Aggregate in Liquor verdünnt werden. Die Analyse von Liquorproben von MSA- und PD-Patienten zeigte, dass das Assay noch optimiert werden muss, aber ein Austausch der Antikörper und ein Ausbau der Auswertung sind leicht zu implementieren und besitzen viel Potential die Sensitivität und Spezifität des Assays zu verbessern.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	17.11.2015
Dateien geändert am:	17.11.2015
Promotionsantrag am:	01.12.2014
Datum der Promotion:	03.02.2015