Dokument: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Kupfer-Homöostase in Corynebacterium glutamicum

Titel:Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Kupfer-Homöostase in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:Structural and functional investigations of copper homeostasis in Corynebacterium glutamicum
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20151102-104854-9
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Schuplezow, Xenia [Autor]
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Dateien vom 29.10.2015 / geändert 29.10.2015
Beitragende:Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Kupfer ist für viele Organismen ein wichtiges Spurenelement, jedoch wirkt es bei erhöhten Konzentrationen toxisch. In dieser Arbeit wurden drei Aspekte der Kupfer-Homöostase in Corynebacterium glutamicum, einem Gram-positiven Bakterium, welches als Modelorganismus in der mikrobiellen Biotechnologie fungiert, untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Strukturaufklärung der Sensorkinase CopS erfolgen. CopS ist eine membrangebundene Histidinkinase mit zwei Transmembranhelices. Als Teil des Zweikomponenten-Signaltransduktionssystems CopSR ist CopS für die Erkennung erhöhter Kupferkonzentrationen und die Transkriptionsaktivierung einer Reihe von Genen verantwortlich, die an der Kupfer-Stress-Antwort beteiligt sind. Es wird angenommen, dass CopS Kupfer-Ionen über eine sehr kurze extrazytoplasmatische Domäne detektiert, die zwischen den beiden Transmembranhelices liegt. Zwei unterschiedliche Ansätze wurden für die Strukturaufklärung von CopS verfolgt. Zum einen wurde das komplette CopS Protein in Escherichia coli überproduziert, aufgereinigt und kristallisiert. Die Kristalle zeigten jedoch eine innere Asymmetrie und konnten daher nicht für eine Röntgenstrukturanalyse verwendet werden. Zum anderen wurden Versuche unternommen, die Proteinstruktur mittels Festkörper-NMR aufzuklären. Da das vollständige CopS-Protein für diesen Ansatz zu groß war, wurde eine Reihe von 14 C-terminal verkürzten CopS-Derivaten konstruiert und bezüglich der Möglichkeit zur Überproduktion und Aufreinigung getestet. Es stellte sich heraus, dass ein Konstrukt, genannt NGHMCopS206, für weitere Analysen geeignet war. Die Methoden für die Überproduktion, Aufreinigung und Rekonstitution in Proteoliposomen wurden für dieses Derivat sorgfältig optimiert, um eine maximale Proteinausbeute zu erlangen. Die Festkörper-NMR-Messungen der resultierenden Proteoliposomen zeigten, dass die Mobilität der Probe zu hoch war und nur die Aminosäuren der beiden Transmembranhelices detektiert werden konnten.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Bestimmung des Kupfer-Mangel-Stimulons in C. glutamicum. Zu diesem Zweck wurde ein Transkriptomvergleich zwischen dem C. glutamicum Wildtyp unter Kupfer-Mangel-Bedingungen und dem Wildtyp bei regulären Kupferkonzentrationen durchgeführt. Insgesamt wiesen 46 Gene einen mehr als zweifach veränderten mRNA-Spiegel (p-Wert ≤ 0,05) bei Kupfer-Mangel auf, davon zeigten 25 Gene eine erhöhte und 21 Gene eine verringerte Expression. Die Gene cydABDC, die für die Cytochrom-bd-Oxidase und einen funktionell dazugehörigen ABC-Typ-Exporter kodieren, zeigten die am stärksten erhöhten mRNA-Spiegel, wohingegen die ctaE-qcrAB-Gene, kodierend für Untereinheiten des Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplexes, verringerte mRNA-Spiegel zeigten. Dies deutet auf einen Wechsel von der Kupfer-abhängigen zur Kupfer-unabhängigen terminalen Oxidase.
Die Cytochrom-aa3-Oxidase ist derzeit das einzige bekannte Kupfer-abhängige Protein in C. glutamicum. Es enthält zwei Kupfer-Zentren, CuA in der Untereinheit II (CtaC) und CuB in der Untereinheit I (CtaD). Bioinformatische Analysen zeigten, dass manche Gene mit einem veränderten mRNA-Spiegel unter Kupfer-Mangel für Proteine kodieren, die an der Bereitstellung von Kupfer-Ionen zu CuA oder CuB beteiligt sein könnten. Zwei dieser Gene wurden im dritten Teil der Arbeit näher untersucht. Das Cg2699-Protein ist ein integrales Membranprotein mit 16 Transmembranhelices. Aufgrund seiner Zusammensetzung aus einer N-terminalen CopD-Domäne und einer C-terminalen CtaG-Domäne könnte Cg2699 eine doppelte Funktion als Kupfer-Importer und Assemblierungsprotein für das CuA- oder CuB-Zentrum ausüben. Die Eigenschaften einer Δcg2699-Deletionsmutante unterstützten diese Annahme stark: (i) das Wachstumsverhalten auf BHI-Agarplatten ähnelte dem der ΔctaD-Deletionsmutante, der die Untereinheit I der Cytochrom-aa3-Oxidase fehlt; (ii) die globale Genexpression unter regulären Kupferkonzentrationen war vergleichbar mit der des Wildtyps bei Kupfer-Mangel; (iii) die Δcg2699-Mutante zeigte eine bessere Resistenz gegenüber erhöhten Kupferkonzentrationen als der Wildtyp; (iv) die Bildung der Cytochrom-aa3-Oxidase und des Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplexes war gestört, was anhand der erfolglosen Ko-Reinigungsversuche entsprechender Untereinheiten gezeigt werden konnte. Cg1881 ist ein periplasmatisches Protein, das in der Membran mit einer C-terminalen Transmembranhelix verankert ist. Das Protein zeigt Ähnlichkeiten zu CopC, einem blauen Kupferprotein, welches pro Proteinmolekül ein Kupfer-Ion bindet. Ähnlich wie die Δcg2699-Mutante wuchs die ΔcopC-Deletionsmutante langsam auf BHI-Agarplatten, war resistenter gegenüber erhöhten Kupferkonzentrationen und wies eine fehlerhafte Assemblierung des Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplexes auf. Im Gegensatz zur Δcg2699-Mutante zeigte die ΔcopC-Mutante keinen Wachstumsdefekt in Glucose-Minimalmedium mit regulärer Kupferkonzentration. Diese Eigenschaften unterstützen die Rolle von CopC als Kupfer-Chaperon, welches für die Assemblierung eines stabilen Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplexes benötigt wird, indem es möglicherweise Kupfer-Ionen zu Cg2699 oder zum periplasmatischen CuA-Zentrum der Untereinheit II transportiert.

Copper is an important trace element for many organisms, but toxic at elevated concentrations. This thesis covered three issues of copper homeostasis in Corynebacterium glutamicum, a Gram-positive soil bacterium serving as a model organism in microbial biotechnology. The first subject aimed at the structure determination of the sensor kinase CopS. CopS is a membrane-bound histidine kinase with two transmembrane helices and part of the two-component signal transduction system CopSR, which is required for sensing elevated copper concentrations and activating transcription of a set of genes involved in the copper stress response. It is assumed that CopS senses the extracellular copper concentration via a very short extracytoplasmic domain located between the two transmembrane helices. Two different approaches were pursued for CopS structure elucidation. On the one hand, the complete CopS protein was overproduced in Escherichia coli, purified and crystallized. However, the crystals showed inner asymmetry and therefore could not be used for X-ray structure determination. On the other hand, attempts were made to apply solid-state NMR for structure determination. As the complete CopS was too large for this approach, a series of 14 C-terminally shortened CopS derivatives were constructed and tested with respect to overproduction and purification. One of the variants turned out to be suitable for further analysis, termed NGHMCopS206. The methods for overproduction, purification, and reconstitution into proteoliposomes of this derivative were carefully optimized to achieve the maximal protein yield. The solid-state NMR measurement of the resulting proteoliposomes showed that the mobility of the sample was too high and only the amino acids of the two transmembrane helices were detectable.
The second subject of this thesis dealt with the definition of the copper starvation stimulon of C. glutamicum. For this purpose, a transcriptome comparison was performed with wild-type cells cultivated under copper starvation and copper sufficiency. Of the 46 genes with a more than 2-fold altered mRNA level (p-value ≤0.05) under copper starvation, 25 and 21 genes showed increased and decreased expression, respectively. The cydABDC genes encoding cytochrome bd oxidase and a functionally related ABC-type exporter showed the strongest increased mRNA levels, whereas the ctaE-qcrAB genes encoding subunits of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex showed decreased mRNA levels. This indicated a switch from a copper-dependent to a copper-independent terminal oxidase.
Cytochrome aa3 oxidase is currently the only known copper-dependent protein of C. glutamicum and contains two copper centres, CuA in subunit II (CtaC) and CuB in subunit I (CtaD). Bioinformatic analysis indicated that some of the genes with an elevated mRNA level under copper starvation might be involved in targeting copper ions to CuA or CuB. Two of these were studied in more detail in the third part of this thesis. The Cg2699 protein is an integral membrane protein with 16 putative transmembrane helices. Based on its composition of an N-terminal CopD domain and a C-terminal CtaG domain, Cg2699 might be a bifunctional protein acting as copper importer and as assembly protein for the CuA or CuB centre. The properties of a Δcg2699 deletion mutant strongly supported this assumption: (i) its growth behaviour on BHI agar plates resembled that of a ΔctaD deletion mutant lacking subunit I of cytochrome aa3 oxidase: (ii) its global gene expression under copper sufficiency was comparable to that of the wild type under copper starvation; (iii) it showed a higher resistance against elevated copper concentrations than the wild type; (iv) the assembly of cytochrome aa3 oxidase and of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex was disturbed, as shown by the failure to co-purify the corresponding subunits. Cg1881 is a periplasmic protein anchored to the membrane by a C-terminal transmembrane helix. It shows similarity to CopC, a blue copper protein that sequesters one copper ion per protein molecule. Like the Δcg2699 mutant, a ΔcopC mutant grew slowly on BHI agar plates, was more resistant towards elevated copper concentrations, and was disturbed in the assembly of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex. In contrast to the Δcg2699 mutant, the ΔcopC mutant showed no growth defect in copper-sufficient glucose minimal medium. These characteristics support a role of CopC as a copper chaperone required for assembly of a functional cytochrome aa3 oxidase, possibly by targeting copper to Cg2699 or to the periplasmic CuA centre in subunit II.
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Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:02.11.2015
Dateien geändert am:02.11.2015
Promotionsantrag am:12.05.2015
Datum der Promotion:23.06.2015
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