Dokument: Die Octopindehydrogenase der Pilgermuschel Pecten maximus: Neue Einblicke in die Struktur und den Reaktionsmechanismus

Titel:	Die Octopindehydrogenase der Pilgermuschel Pecten maximus: Neue Einblicke in die Struktur und den Reaktionsmechanismus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3615
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070216-110603-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müller, Andre [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Grieshaber, Manfred K. [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Pilgermuschel, Pecten maximus, Octopindehydrogenase, ODH, Isozyme, anaerobe Glykolyse, katalytische Triade, Kristallisation, Bindungsreihenfolge, gerichtete Mutagenesescallop, Pecten maximus, octopine dehydrogenase, ODH, isozyme, anaerobic glycolysis, catalytic triad, crystallization, binding order, site-directed mutagenesis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Octopindehydrogenase gehört zur Familie der Opindehydrogenasen, den terminalen Enzymen der anaeroben Glykolyse in unzähligen Invertebraten. Die ODH katalysiert die reduktive Kondensation von Pyruvat und L-Arginin in Anwesenheit von NADH, wodurch D Octopin entsteht. Nach Aufklärung der Primärstruktur der ODH aus der Pilgermuschel Pecten maximus und heterologer Expression des Enzyms in E. coli sind ausreichende ODH-Mengen für strukturelle Untersuchungen verfügbar (Janßen, 2000). In der vorliegenden Arbeit wurden die Primärstrukturen von drei verschiedenen ODH-Isoenzymen identifiziert. Es ist jeweils nur der Austausch einer einzelnen Aminosäure für die beobachtete, unterschiedliche Wanderung der Isozyme in der nativen PAGE verantwortlich. Diese so genannten Allozyme unterscheiden sich dabei nicht in ihren kinetischen Eigenschaften. Weiterhin wurden Reinigungsprotokolle für rekombinante ODH mit einer Histidin-Fusion als auch für das rekombinante Enzym ohne Affinitätsmarkierung etabliert bzw. verbessert. Die gereinigte ODH wurde in Kristallisationsversuchen eingesetzt. Es konnten drei Bedingungen identifiziert werden, bei denen sich Protein-Kristalle bildeten. Allerdings wuchsen die Kristalle bevorzugt nur in zwei Dimensionen. Die besten Kristalle wurden röntgenographisch untersucht, waren allerdings für die Datensammlung nicht geeignet, da es sich nicht um Einkristalle handelte. Mögliche Ursachen, z.B. Mikroheterogenitäten der ODH-Präparation, wurden als Grund diskutiert. Durch NMR-spektroskopische Untersuchungen konnte die Bindungsreihenfolge der Substrate auf unkonventionelle Weise bestimmt werden. Zuerst muss das Coenzym NADH an die ODH binden. Es kommt zu einer Konformationsänderung, die eine Bindung von L-Arginin ermöglicht. Durch Bindung von L-Arginin an den ODH-NADH-Komplex ändert sich die Konformation erneut und das Coenzym wird in räumliche Nähe zum Übergangszustand der Reaktion gebracht, auf den ein Hydridion übertragen wird. Die ODH verhindert so, dass durch Bindung von Pyruvat und NADH bereits Laktat entsteht. Durch gerichtete Mutagenese konnten neue Einblicke in den molekularen Reaktionsmechanismus der ODH und die an der Katalyse beteiligten Aminosäuren erhalten werden. Es wurden drei Aminosäuren identifiziert, welche die Aufgabe einer katalytischen Histidin-Aspartat-Arginin Triade in der ODH übernehmen könnten. Die Carboxylgruppe des Pyruvats wird durch Arginin 324 stabilisiert. Histidin 212 fungiert als ein Säure-Base-Katalysator. Neben der korrekten Orientierung des Übergangszustandes überträgt das Histidin ein Proton auf die Carbonylgruppe. Aspartat 329 sorgt für eine ausreichende Azidität des Histidins und ermöglicht so die Protonenübertragung. Aminosäurereste, von denen man vermutete, dass sie für die Substratspezifität verantwortlich sein könnten, wurden ebenfalls durch gerichtete Mutagenese untersucht. Die Substratspezifität der ODH für Aminosäuren konnte jedoch nicht verändert werden. Wahrscheinlich sind die, für die Determinierung der Substratspezifität verantwortlichen Aminosäuren durch eine rationale Herangehensweise ohne vorhandene Kristallstruktur der ODH nicht erfassbar. Octopine dehydrogenase belongs to the family of opine dehydrogenases terminating anaerobic glycolysis in many invertebrates. ODH catalyses the reductive condensation of pyruvate and L-arginine resulting in the synthesis of D-octopine. NADH is oxidized as in the lactate dehydrogenase mediated reaction to maintain the redox balance during anaerobiosis. The gene coding for ODH of the scallop Pecten maximus was cloned and ODH can be heterologously overexpressed in E. coli (Janßen, 2000). Aim of this work was the optimization of purification conditions for the c-terminally elongated ODH as well as for the recombinant enzyme without an affinitytag. Purified ODH was used in various crystallization trials. Three conditions were found giving yield to crystalline protein structures. ODH crystals favored growth in two dimensions resulting in small needles. The best crystals obtained were examined using X-ray diffraction analysis. Unfortunately, they are not suited for data collection, because they consist of staged thin plates. Probably a microheterogeneous ODH-preparation resulting from deamidation of asparagine residues is responsible inadequate crystallization. NMR-spectroscopy was used to clarify the binding order of ligands to ODH. NADH must bind to the enzyme first, resulting in conformational changes allowing the binding of L arginine which induces yet another conformational change avoiding the formation of lactate caused by reduction of pyruvate through NADH. Problems with deuteration of ODH prevented the resonance assignment of NMR-spectra but chemical shifts could be used to calculate dissociation constants for NADH, NAD+ und L-arginine. Site-directed mutagenesis allowed new insights into the molecular reaction mechanism of ODH. Mutagenesis of conserved arginine, histidine and aspartate residues showed that these amino acids could assume the function of a catalytic triad in octopine dehydrogenase. The carboxyl group of pyruvate is stabilized by arginine 324. As well as orienting the substrate, histidine 212 acts as an acid-base catalyst by donating a proton to the carbonyl group of pyruvate. The acidity of this histidine is increased by the proximity of aspartate 329. Amino acid residues supposed to be involved in binding of amino acid substrate could not be identified by site-directed mutagenesis. Substrate specificity of ODH could not be changed towards another amino acid. Obviously these residues cannot be found using a rational approach without a crystal structure of ODH.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	21.01.2007
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	07.12.2006
Datum der Promotion:	07.12.2006