Dokument: Entwicklung von Verfahren zur spezifischen PCR-Diagnostik von opisthorchiiden Trematoden (Gatt. Opisthorchis, Clonorchis u. a.)
| Titel: | Entwicklung von Verfahren zur spezifischen PCR-Diagnostik von opisthorchiiden Trematoden (Gatt. Opisthorchis, Clonorchis u. a.) | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3596 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101130-105048-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Müller, Boris [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter] Prof. Dr. D'Haese, Jochen [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | PCR, Diagnostik, Clonorchiasis, Opisthorchiasis, PrimerPCR, diagnosis, clonorchiasis, opisthorchiasis, primer | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Infektionen mit Leberegeln der Familie Opisthorchiidae, insbesondere der humanpathogenen Arten Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini und Opisthorchis felineus stellen in weiten Teilen Südost-Asiens und in den Staaten der ehemaligen UdSSR ein ernstzunehmendes gesundheitliches Problem dar. Infektionen erfolgen durch orale Aufnahme von Metazerkarien mit rohem Süßwasserfisch. Die Würmer parasitieren in den Gallengängen und verursachen Gewebeschäden, die zu Cholangiokarzinomen führen können. Der Entwicklungszyklus der Opisthorchiiden schließt bestimmte Süßwasserschnecken als erste und Fische als zweite Zwischenwirte ein. Endwirte sind fischfressende Säugetiere einschließlich des Menschen. Eine Bestimmung der einzelnen Entwicklungsstadien bis zur Art ist aufgrund ihrer großen morphologischen Ähnlichkeit der Opisthorchiiden untereinander und mit den anderen Digenea schwierig. Eine eindeutige Artbestimmung ist mit molekularer Technik möglich. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren lediglich PCR-Nachweise für O. viverrini bzw. O. felineus beschrieben worden. Daher wurde ein Primer-Paar für die artspezifische Identifikation von C. sinensis entwickelt. Für die Diagnose am Patienten ist es unerheblich, welche Art die Erkrankung verursacht, da gegen alle Opisthorchiiden dieselbe Therapie durchgeführt wird. Daher kommt es bei Inspektionen im Sinne von Lebensmittelkontrollen ebenfalls nicht darauf an, mit welcher opisthorchiiden Art die Fische infiziert sind. Aus diesem Grund wurde ein sensitives PCR-System entwickelt, das es ermöglicht in einem Testansatz und mit nur einem Primer-Paar alle opisthorchiiden Trematoden sicher nachzuweisen und hierbei von anderen Trematoden zu unterscheiden. Um ein solches Primer-Paar zu entwickeln, waren Sequenzen notwendig, die bei sämtlichen Opisthorchiiden identisch sind, sich aber zugleich von allen anderen Trematoden unterscheiden. Solche Sequenzen schienen in der ITS2-Region der ribosomalen DNA zu existieren. Von zahlreichen Trematodenarten war die ITS2-Region bekannt, aber nur von zwei Opisthorchiiden (C. sinensis und O. viverrini). Daher wurde die ITS2-Region von weiteren Opsithorchiiden sequenziert. Für O. felineus und die beiden ebenfalls humanpathogenen Arten Metorchis xanthosomus und Pseudamphistomum truncatum wurde dies erfolgreich durchgeführt. Es bestätigte sich, dass alle diese Opisthorchiiden Sequenzbereiche enthielten, die unter ihnen identisch und gleichzeitig verschieden von den anderen Trematoden waren. Somit war es möglich, einen spezifischen PCR-Nachweis für Opisthorchiiden zu führen. PCR-Reaktionen benötigen DNA in ausreichender Reinheit. Die Wirtsgewebe bzw. Fäkalien, in denen sich die einzelnen Entwicklungsstadien der opisthorchiiden Leberegel befinden, enthalten aber Substanzen, die den Ablauf der PCR stark inhibieren können. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Aufreinigungs- und Präparationsverfahren erarbeitet, die es ermöglichen, amplifizierbare Parasiten-DNA aus den entsprechenden Zwischenwirten bzw. aus den Eiern in den Fäzes der Endwirte zu isolieren. Die entwickelten Verfahren beruhen auf kostengünstigen Reagenzien, sind schnell und einfach durchführbar und eignen sich für die parasitologische Routine-Diagnostik.Liver flukes of the family Opisthorchiidae with the human pathogenic species Clonorchis sinensis, Opisthorchis. viverrini and O. felineus cause severe fish-borne diseases in South East Asia and Eastern parts of the countries of the former Soviet Union. The human infections occur by eating raw or undercooked cyprinoid fishes harbouring infectious metacercariae. The worms inhabit the bile ducts and provoke hepatobiliary damages like cholangitis which may lead to cholangiocarcinomas. The opisthorchiid flukes have an aquatic life cycle using freshwater snails as first and cyprinid fishes as second intermediate hosts, and final hosts are fish eating mammals including humans. To date it remained difficult to determine the parasite stages of the opisthorchiid liver flukes to the species level since they appear morphologically very similar among one another and to other digenea. In contrast a differentiation on species level is possible by molecular techniques. At the point of this study there existed PCRs for the species-specific detection of O. viverrini and O. felineus. Thus, primers have been developed that enable a highly sensitive and species-specific detection of C. sinensis. Since all species of the opisthorchiids cause the same health problems it makes sense to use a single test-system for their diagnosis. However, for appropriate treatment of patients, e.g. with praziquantel it is not needed to determine the exact species. Thus, a primer pair for the specific detection of all opisthorchiid liver flukes has been developed. The study revealed that the examined species of the family Opisthorchiidae share extreme homologies of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequence. The ITS2 sequences of other digenea are clearly different, especially at the loci where the designed primer pair anneals. The primer pair appears to be specific for members of the Opisthorchiidae. The nucleotide sequences we used to develop the primers for the opisthorchiid species C. sinensis, O. viverrini, O. felineus, Pseudamphistomum truncatum and Metorchis xanthosomus. Sequences from C. sinensis and O. viverrini sequences were registered in GenBank. Nucleotide sequences of the ITS2 region of O. felineus, Metorchis xanthosomus and Pseudamphistomum truncatum have not been reported before and have been determined in the present study. PCRs are dependent on sufficient clean template DNA. Thus, in this study procedures for rapid and easy preparation of DNA of parasite stages from intermediated hosts and from the eggs in stool samples of the definitive hosts have been established. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 07.01.2007 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.12.2006 | |||||||
| Datum der Promotion: | 19.12.2006 |
