Dokument: Protein Polyubiquitinierung und oxidative Schädigung in der Hepatischen Enzephalopathie

Titel:	Protein Polyubiquitinierung und oxidative Schädigung in der Hepatischen Enzephalopathie
Weiterer Titel:	Protein polyubiquitination and oxidative damage in hepatic encephalopathy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=35937
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20151019-100033-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Klose, Jasmin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.10.2015 / geändert 09.10.2015
Beitragende:	Professor Aktas, Orhan [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	polyubiquitination, oxidation, hepatic encephalopathy, hippocampus
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die hepatische Enzephalopathie (HE) stellt eine häufige und gravierende neuropsychiatrische Störung dar, welche als Folge von chronischem oder akutem Leberversagen entsteht. Klinisch zeigen HE Patienten ein weites Spektrum von Symptomen; vor allem kognitive Einschränkungen und Bewegungsstörungen bis hin zu Koma und zum Tode. Final kann HE zu Koma und zum Tode führen. Obgleich die genaue Pathophysiologie bisher nicht aufgeklärt ist, wird Ammonium als zentrales Neurotoxin für die Pathogenese der Erkrankung angesehen. So führt ein gestörter Ammonium Metabolismus zu einer Erhöhung der systemischen und zentralnervösen Ammoniumspiegel im Patienten und damit klinisch zur Ausbildung einer Hyperammonämie. Im Gehirn bewirkt Ammonium eine Schwellung von Astrozyten und führt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. So entsteht oxidativer Stress, der im Gehirngewebe eine veränderte Genexpression, RNA Oxidation sowie post translationale Proteinmodifikationen zur Folge hat. Gegenwärtig wird oxidativer Stress als ein mechanistisches Konzept für die Pathogenese von HE diskutiert. Oxidativer Stress führt möglicherweise zu neuroinflammatorischen Prozessen und verursacht so glioneuronale Komplikationen im zentralen Nervensystem. Obwohl die Beteiligung von oxidativem Stress als gesichert gilt, sind die Mechanismen bisher nicht im Detail verstanden. Unlängst wurde über die Beteiligung von Mikroglia für die Pathogenese von HE spekuliert, da gezeigt werden konnte, dass Hyperammonemie die Aktivierung, Phagozytose und die inflammatorische Antwort von Mikroglia Zellen beeinflusst. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Effekten von Hyperammonemie auf Protein Oxidation und post translationale Proteinmodifikationen wie Protein Ubiquitinierung und –Tyrosinnitrierung. Weiterhin beleuchteten wir die zelluläre antioxidative Reaktion in Bezug auf die Regulation von antioxidativen Enzymen sowie die Stress Antwort des endoplasmatischen Retikulums (ER). Experimentell wendeten wir drei verschiedene Paradigmen an. Zum einen analysierten wir humane post mortem Gehirnbiopsien, zum anderen untersuchten wir in vivo die Hippocampi von akut hyperammonemischen Mäusen und erforschten mittels in vitro Versuchen die Antwort von Mikroglia auf Ammonium Exposition. So erbringen wir zum erstmals den Nachweis für eine Akkumulation von polyubiquitinierten Proteinen in Gehirnen chronischer HE Patienten. Bemerkenswerterweise fanden wir in den humanen post mortem Gehirnbiopsien eine Geninduktion der Immunoproteasom Untereinheiten LMP2 und LMP7. Wie unsere Gruppe zuvor publizierte, stellt LMP7 eine entscheidende Untereinheit für den Umsatz beschädigter Proteinen dar, welche unter oxidativem Stress in inflammatorischem Milieu entstehen. Die Induktion von LMP7 und die Akkumulation polyubiquitinierter Proteine im Gehirn von HE Patienten sprechen daher für eine gestörte Proteinhomöostase in Folge der Pathogenese von HE. Ferner belegen wir, dass eine akute Ammonium Intoxikation im Hippocampus von Mäusen und in kultivierten Mikroglia Zellen eine Akkumulation von polyubiquitinierten Proteinen, Protein Oxidation sowie eine erhöhte proteasomale Aktivität begünstigt. Erstmals beschreiben wir in einem HE Modell eine Beteiligung der ER Stress Antwort. Wir detektierten die hippocampale Induktion von Calreticulin, Grp94 und Chop; Gene , die in der Antwort auf ungefaltete Proteine (unfolded protein response, UPR) des ER beteiligt sind. Weiterhin zeigen wir in unserem HE Tiermodell zum ersten Mal, dass eine Beeinträchtigung der adulten hippocampalen Neurogenese durch akute Hyperammonemie hervorgerufen wird. In vitro führte die Ammonium Behandlung von Mikroglia Zellen zur Inhibierung der Phagozytose von Myelindebris. Überdies verursachte Ammonium eine Protein Polyubiquitinierung und –Tyrosinnitrierung in Mikroglia. Die erwartetermaßen eingeschränkte Phagozytose sowie die Akkumulation polyubiquitinierter Proteine waren reversibel durch zeitgleiche Behandlung mit dem Antioxidans N Acetylcystein. Des Weiteren förderte Ammonium die mikrogliäre Expression der antioxidativ wirksamen Enzyme HO1 und Trx1, jedoch ohne Regulation immunoproteasomaler Gene oder inflammatorischer Zytokine. Zusammenfassend betrachtet unterstreicht diese Studie nachdrücklich den schädlichen Effekt der Ammonium Toxizität in vivo und in vitro. Unsere Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass für chronische und akute Hyperammonemie differentielle regulatorische Mechanismen greifen. In beiden Modellen fördert Ammonium ein pro oxidatives Milieu und generiert post translationale Proteinmodifikationen. Wir erbringen den Nachweis für eine Protein Oxidation und eine veränderte proteasomale Aktivität, welche gemeinsam Einfluss auf die physiologische zelluläre Proteinhomöostase nehmen. Der gestörte Umsatz von Proteinen resultiert in einer oxidativen Schädigung des Hippocampus und der Mikroglia Zellen und könnte so zur Pathogenese der HE beitragen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der neuronalen Dysfunktion durch Hyperammonemie bei und implizieren neuartige Aspekte für zukünftige Therapieansätze in der Behandlung der HE. Hepatic encephalopathy (HE) is a frequent and serious neuropsychiatric disorder resulting from chronic or acute liver failure. Among a broad spectrum of symptoms, HE patients exhibit alterations of behaviour and personality, impaired cognition and motor dysfunction. Ultimately HE may result in coma and death. Although the exact pathophysiology remains to be resolved, ammonia is thought to be the central neurotoxin for development and pathogenesis of HE. A disturbed ammonia metabolism gives rise to systemic hyperammonemia. Reaching the brain, elevated ammonia levels provoke swelling of astrocytes along with generation of reactive oxygen species (ROS). Subsequently, oxidative stress leads to altered gene expression, RNA oxidation and post translational protein modifications among other potential detrimental effects. To date, oxidative stress is an emerging mechanistic concept for the pathogenesis of HE and may act in concert with neuroinflammation. Thereby it may contribute to glioneuronal complications and a deranged central nervous system (CNS) network. Although the implication of oxidative stress in HE is well accepted, the precise mechanisms involved are not understood. Recently an involvement of microglia cells for HE pathogenesis has been proposed since hyperammonemia affects microglia activation, phagocytosis and the inflammatory response. In the present study we addressed the effect of hyperammonemia on protein oxidation and involvement of post translational protein modifications such as protein ubiquitination and nitrotyrosinylation. We also investigated the cellular antioxidant response in terms of antioxidant enzyme regulation and the endoplasmic reticulum (ER) stress response by application of three different approaches. We studied human post mortem brain samples, analyzed the hippocampi of acutely hyperammonemic mice and investigated the microglial response to ammonia. For the first time, we provide evidence for an accumulation of polyubiquitinated proteins in the brains of chronic HE patients. Notably, in the human post mortem brain samples gene expression of immunoproteasome subunits LMP2 and LMP7 was induced. As our group published earlier, LMP7 is critical for the turnover of damaged proteins under oxidative stress and inflammatory conditions. Hence, induction of LMP7 and accumulation of polyubiquitinated proteins may argue for a disturbed protein homeostasis and involvement of immunoproteasome function in the pathophysiology of HE. In the mouse hippocampus and in microglia cells we found that acute ammonia intoxication likewise favors accumulation of polyubiquitinated proteins, induces protein oxidation and increases proteasomal activity. Furthermore, we observed an involvement of the ER stress response as demonstrated by induction of the unfolded protein response (UPR) genes Calreticulin, Grp94 and Chop. Additionally, we demonstrate an impairment of adult hippocampal neurogenesis in our HE animal model. In vitro, treatment with ammonia compromised microglial myelin phagocytosis and provoked protein polyubiquitination and nitrotyrosinylation in microglia cells. Impaired phagocytosis and accumulation of polyubiquitin conjugates were reversible by treatment with the antioxidant N acetylcysteine. Moreover, ammonia promoted microglial expression of antioxidant enzymes HO1 and Trx1, however without involvement of immunoproteasome genes or inflammatory cytokines. Taken together, this study provides further evidence for the detrimental effect of ammonia toxicity in vivo and in vitro. Our results suggest differential regulatory mechanisms in chronic and acute hyperammonemia. In both models ammonia promotes a pro oxidative milieu and generates post translational protein modifications. We found evidence for protein oxidation and an altered proteasomal activity, thus impacting on the physiological cellular protein homeostasis. The oxidative damage in the hippocampus and in microglia cell which results from a disturbed protein turnover may in part contribute to HE pathogenesis.Hence, the results of this study may help to elucidate the underlying molecular mechanisms of neuronal cell dysfunction caused by hyperammonemia and may provide novel aspects to future therapeutic approaches for HE treatment.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	19.10.2015
Dateien geändert am:	19.10.2015
Promotionsantrag am:	24.06.2015
Datum der Promotion:	15.09.2015