Dokument: Wirkung von Acyldepsipeptid Antibiotika auf die Clp-Protease von Mykobakterien und Staphylococcus aureus

Titel:	Wirkung von Acyldepsipeptid Antibiotika auf die Clp-Protease von Mykobakterien und Staphylococcus aureus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=35926
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161109-084930-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Famulla, Kirsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,12 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.10.2015 / geändert 08.10.2015
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile, in denen der Wirkmechanismus von Acyldepsipeptid Antibiotika (ADEPs) gegen verschiedene pathogene Bakterien genauer untersucht wird. Der erste Teil befasst sich dabei mit der Wirkung gegen Mykobakterien und der zweite Teil mit der Wirkung gegen Staphylococcus aureus. Das Target von ADEPs ist die proteolytische Untereinheit der caseinolytischen Protease, ClpP. In Anwesenheit von ADEPs bildet sich im Modellorganismus Bacillus subtilis ein tetradekamerer ClpP Komplex, mit vergrößerter Eintrittspore zum katalytischen Zentrum, so dass es zu einem unkontrollierten Verdau von Proteinen kommt. Ein besonders sensitives Target für den ADEP-ClpP Komplex ist dabei das Zellteilungsprotein FtsZ. Eine zweite Konsequenz von ADEP Bindung an ClpP ist, dass Clp-ATPasen, die normalerweise die natürlichen Substrate von ClpP entfalten und dem aktiven Zentrum zuführen, nicht mehr an ClpP binden können, wodurch zusätzlich alle natürlichen Funktionen von ClpP durch ADEPs inhibiert werden. Trotz dieses innovativen dualen Wirkmechanismus und einer vielversprechenden Wirksamkeit gegen verschiedene Grampositive Bakterien, konnten ADEPs bisher nicht klinisch weiterentwickelt werden, da es aufgrund von Mutationen im Target, zu einer zu schnellen Resistenzentwicklung in den untersuchten Bakterien kam. Der Grund für diese hohe Mutationsrate ist, dass ClpP in diesen Organismen nicht essentiell für das Wachstum benötigt wird. In Mykobakterien ist jedoch eine der vielen Besonderheiten, dass sie zwei ClpP Homologe exprimieren (ClpP1 und ClpP2), die in einem Operon kodiert werden und beide essentiell für das Wachstum der Bakterien sind. Daher wurde zu Beginn dieser Arbeit die Hypothese aufgestellt, dass die Resistenzproblematik von ADEPs in Mykobakterien weniger stark ausgeprägt sein könnte. Eine genaue Resistenzrate konnte jedoch nicht bestimmt werden, da bei langsam wachsenden Mykobakterien eine lange Inkubationszeit nötig ist und ADEPs, wie in dieser Arbeit nachgewiesen wurde, in wässriger Lösung eine geringe Stabilität besitzen. Kolonien, die von ADEP haltigen Agarplatten isoliert wurden, waren in anschließenden Untersuchungen nicht ADEP resistent. Da gegen den Erreger der Tuberkulose, Mycobacterium tuberculosis, aufgrund der begrenzten Anzahl wirksamer Antibiotika und der dramatischen Entwicklung multiresistenter Keime, dringend neue Antibiotika benötigt werden, wurde die Untersuchung der Wirkung von ADEPs gegen diese Bakterien dennoch weiter verfolgt. Die Minimale Hemmkonzentration von ADEPs gegen M. tuberculosis und den Modellorganismus Mycobakterium bovis BCG wurde ermittelt, und liegt unter anderem bei ADEP2 mit 8 – 16 μg/ml in einem moderaten Wirkungsbereich. Außerdem sollte in dieser Arbeit die Frage geklärt werden, ob ADEPs weiterhin den oben beschriebenen dualen Wirkmechanismus haben, wenn es zwei potentielle Targets in der Zelle gibt, die beide essentiell sind. Um diese Frage zu beantworten, wurde ein M. bovis BCG Stamm konstruiert, dessen clpP1P2 Expression in Abhängigkeit von Anhydrotetrazyklin (ATc) herunterreguliert werden kann. Je geringer die clpP1P2 Expression in diesem Stamm war, umso besser wurde die Wirksamkeit von ADEPs. Vergleichsweise wurde dieser Versuch auch mit einem B. subtilis Stamm durchgeführt, dessen clpP Expressionsmenge sich durch die Xylosekonzentration regulieren lässt. Hier wurde das umgekehrte Ergebnis erzielt. Umso geringer die clpP Expression in B. subtilis war, umso schlechter wurde die Wirksamkeit von ADEPs. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass ADEPs in B. subtilis hauptsächlich über die Aktivierung von ClpP zum unkontrollierten Proteinverdau wirkt, wohingegen die Wirkung gegen Mykobakterien hauptsächlich auf die Inhibierung der natürlichen Funktionen der essentiellen Clp-Protease zurückzuführen ist. Weiterhin wurden in dieser Arbeit in vitro Studien am isolierten ClpP1P2 Komplex aus M. tuberculosis durchgeführt, welcher zunächst durch das Aktivatorpeptid Z-LL aktiviert werden muss. Es wurde gezeigt, dass ADEPs nicht alleine dazu in der Lage sind ClpP1P2 zu aktivieren, Z-LL also nicht ersetzen können. In Anwesenheit von Z-LL kam es aber zu einer 4-5 fachen Stimulierung der Proteaseaktivität durch einige der getesteten ADEP Derivate. Für das Derivat, welches gegen Mykobakterien die höchste MHK zeigte (ADEP2) konnte allerdings nur eine 2 fache Überaktivierung der Proteaseaktivität von ClpP1P2 gemessen werden. Außerdem zeigte sich, dass das Zellteilungsprotein FtsZ in Mykobakterien in Anwesenheit von ADEPs nicht von ClpP1P2 abgebaut wird. Dies deutet daraufhin, dass in Mykobakterien entweder ein anderes Substratspektrum der Protease vorliegt oder dass die Inhibierung der natürlichen Funktionen von ClpP1 und ClpP2 tatsächlich die alleinige Wirkung ist und das der unkontrollierten Abbau von Proteinen, wie FtsZ für die antibakterielle Wirkung nicht relevant ist. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Wirkung von ADEPs an isoliertem ClpP aus Staphylococcus aureus. Obwohl verschiedene ADEP Derivate gegen S. aureus eine gute Wirksamkeit zeigen, ist die Wirkung doch 4 – 8 fach schlechter als gegen andere Grampositive Bakterien. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Grund hierfür ist, dass ADEPs zu isolierten ClpP aus S. aureus eine geringere Affinität aufweisen, als zu ClpP aus B. subtilis. Durch zielgerichtete Mutagenese und Charakterisierung der mutierten ClpP Versionen, konnte die dafür verantwortliche Aminosäureposition in der ADEP Bindetasche identifiziert werden. Allerdings führte diese Mutation nicht nur zu einer höheren Affinität von ADEPs zu ClpP, sondern auch zu einem Oligomerisierungsdefekt der zum Auftreten von Heptameren führte, während das wt ClpP ausschließlich als Tetradekamer isoliert wurde. Dieser Defekt ließ sich durch Anwesenheit von ADEPs ausgleichen, was beweist dass ADEPs nicht nur die Oligomerisierung von monomeren ClpP Molekülen, sondern auch den Zusammenhalt der beiden Heptamere bewirken. Bindung von ADEP muss somit eine Konformationsänderung bewirken, welche Einfluss auf die „handle region“ der ClpP Ringe hat und somit über den bekannten Effekt der Öffnung der Eintrittspore für Substrate hinausgeht. Diese Erkenntnis bildete die Grundlage für weitere mechanistische Studien an ClpP aus S. aureus, in denen letzteres bewiesen werden konnte. In the present work the mode of action of acyldepsipeptide antibiotics (ADEPs) in differennt pathogens was investigated. The work is divided in two parts. In the first part the activity against mycobacteria and in the second part the activity against Staphylococcus aureus was studied. The target of ADEPs is the proteolytic subunit of the caseinolytic protease, ClpP. In the model organism Bacillus subtilis, the presence of ADEPs leads to the formation of a tetradecameric ClpP complex with an enlarged entrance pore to the catalytic center. This lead to an uncontrolled degradation of nascent proteins and of the essential cell cycle protein FtsZ. In addition, the Clp-ATPases which normally unfold the natural substrates of ClpP and direct them to the active sites in the center of the complex, can no longer bind to ClpP. This causes the inhibition of all natural functions of ClpP. Despite this innovative dual mode of action and a promising activity against various Gram-positive bacteria, ADEPs could not be clinically developed so far, due to a variety of mutations in the target, which lead to a rapid development of resistance in the so far studied bacteria, where ClpP is not essential for growth. However in mycobacteria one of the many particularities is that they encode two versions of ClpP (ClpP1 and ClpP2) in one operon and both are essential for growth. Therefore, at the beginning of the present study, one hypothesis was that the resistance of mycobacteria against ADEPs might result in a lower resistance frequency. Due to the long incubation time, which is needed for slow growing mycobacteria, and the low stability of ADEPs in aqueous solution, which was shown in the present study, no clear resistance rate could be determined. Colonies which were isolated from ADEP containing agar-plates, were not resistant against ADEPs in subsequent investigations. Since new antibiotics against the causative agent of tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, are urgently needed, due to the limited number of effective antibiotics and the dramatic development of multi-resistant mycobacteria, the studies on the effect of ADEPs against these bacteria were pursued. The minimal inhibitory concentration (MIC) of ADEPs against M. tuberculosis and the closely related model organism Mycobacterium bovis BCG was determined and showed for example for ADEP2 with 8 - 16 μg/ml a moderate activity. Additionally we wanted to investigate whether ADEPs still have a dual mode of action, in the special case where two potential targets exist in the cell and both are essential for growth. To answer this question, a M. bovis BCG strain was constructed, in which clpP1P2 expression can be down-regulated in the presence of ATc. The lower the clpP1P2 expression was in this strain, the better was the efficacy of ADEPs. For comparative reasons, this experiment was carried out with a Bacillus subtilis strain, in which the clpP expression level could be regulated by the xylose concentration. Here, the opposite result was obtained. A low clpP expression led to a decrease in ADEP activity. This allows the conclusion that in B. subtilis ADEPs act mainly via activation of ClpP, which then leads to an uncontrolled protein degradation. In contrast in mycobacteria the ADEP activity is mainly caused by the inhibition of the natural functions of the essential Clp-Protease. Furthermore, in vitro studies on the isolated ClpP1P2 protein complex from M. tuberculosis were performed. This complex needs to be activated with the activator peptide Z -LL. It was shown that ADEPs alone cannot activate ClpP1P2, which means that they cannot replace Z-LL. Nevertheless the presence of ADEPs led to a 4-5 fold stimulation of protease activity. However, only a 2 fold over-activation of the ClpP1P2 protease activity could be measured for the derivative, which showed the best effect against mycobacterial cells (ADEP2). Furthermore we observed, that the cell division protein FtsZ is not degraded by mycobacterial ClpP1P2 in the presence of ADEPs. This suggests that in mycobacteria either another substrate spectrum of the protease exists, or that the inhibition of the natural functions of ClpP1 and ClpP2 is indeed the only antibiotic effect and an uncontrolled degradation of proteins, such as FtsZ, has no particular impact in mycobacteria. The second part of this thesis focuses on the effect of ADEPs on isolated ClpP from Staphylococcus aureus. Although different ADEP derivatives show a good activity against S. aureus, with MIC values in the range of 0.5 – 8 μg/ml, the effect is 4-8 times lower than against other Gram-positive bacteria. We were able to show, that this is due to a lower affinity of ADEPs for isolated ClpP from S. aureus than for ClpP from B. subtilis. By site-directed mutagenesis and characterization of these mutant ClpP versions, the position in the ADEP binding pocket, which is responsible for this lower affinity, could be identified. However, this mutation did not only lead to a higher affinity to ADEPs, but also to an oligomerisation defect towards heptamers, whereas the wild type (wt) ClpP was always isolated as a tetradecamer. This defect could be compensated by ADEPs, which proves that ADEPs do not only cause the oligomerization of ClpP monomer molecules to a single ring but also the cohesion of the two heptamers. Therefore binding of ADEPs must cause a conformational change that affects the "handle region" of ClpP, going beyond the known effects of the opening the entrance pore for substrates. These findings formed the basis for further mechanistic studies on ClpP of S. aureus, in which the above mentioned hypothesis could be proven.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	09.11.2016
Dateien geändert am:	09.11.2016
Promotionsantrag am:	22.07.2014
Datum der Promotion:	31.10.2014