Dokument: Coexpression von Chaperonen und Faltungskatalysatoren aus Pseudomonas aeruginosa: Neue Strategien zur Optimierung mikrobieller Expressionssysteme

Titel:	Coexpression von Chaperonen und Faltungskatalysatoren aus Pseudomonas aeruginosa: Neue Strategien zur Optimierung mikrobieller Expressionssysteme
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3591
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080804-072249-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kreuz, Andrea [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.08.2008 / geändert 04.08.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Chaperone, Faltungskatalysatoren, Pseudomonas aeruginosa, Coexpression, Proteinexpression, Inclusion Bodies, Proteinfaltung, Genexpressionsbank, Überexpressionchaperone, folding catalysts, Pseudomonas aeruginosa, coexpression, protein expression, inclusion bodies, protein folding, chaperone toolbox, overexpression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Synthese rekombinanter Proteine wurde für wissenschaftliche und industrielle Anwendungen in den letzten Jahren immer bedeutsamer. Hierfür konnte eine Vielzahl unterschiedlicher Expressionssysteme erzeugt und optimiert werden, was bereits heute die Bereitstellung eines breiten Spektrums an Zielproteinen ermöglicht. Häufig findet das Gram-negative Bakterium Escherichia coli als Wirtsorganismus Verwendung, um unterschiedliche Zielgene heterolog zu exprimieren, da es einfach kultiviert und leicht genetisch manipuliert werden kann. Ferner können mit Hilfe dieses Organismus deutlich höhere Ausbeuten erlangt werden als mit eukaryotischen Expressionswirten. Dennoch kommt es bei der heterologen Synthese von Proteinen häufig zu Engpässen, so daß die Ausbeute aktiven Proteins sehr gering ausfällt. Zudem führen Probleme wie zu hohe Expressionsraten, Fehlfaltung oder Instabilität des Zielproteins dazu, daß das Produkt in Form von unlöslichen Proteinaggregaten (Inclusion bodies) akkumuliert. In vielen Fällen konnte gezeigt werden, daß die Coexpression von Chaperon- oder Faltungskatalysatorgenen die Ausbeute aktiven Proteins verbessern kann. Dabei handelt es sich jedoch um einen trial-and-error Ansatz, da bislang nicht vorhersagbar ist, welcher Faltungshelfer bzw. welche Kombination aus Faltungskatalysatoren und Chaperonen benötigt wird, um die Synthese des Zielproteins zu optimieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine umfangreiche Chaperon-Genexpressionsbank (Toolbox) erzeugt. Dazu wurden alle Gene, die für mögliche Faltungsmodulatoren codieren, aus dem vielseitigen, Gram-negativen Bakterium Pseudomonas aeruginosa identifiziert und kloniert. Zusätzlich wurden durch homologe Rekombinationsreaktionen Plasmide hergestellt, die jeweils drei Gene für Faltungskatalysatoren und molekulare Chaperone in randomisierten Kombinationen besitzen. Auf diese Weise konnte erstmalig eine große Anzahl verschiedener einzelner aber auch kombinierter Faltungshelfer in Expressionswirte eingebracht werden, die zur Herstellung von verschiedenen Proteinen mit Fehlfaltungspotential genutzt wurden. Mit Hilfe der erzeugten Chaperon-Toolbox konnte somit der Einfluß einzelner und kombinierter Faltungsmodulatoren auf die Synthese und Aktivität heterologer Proteine untersucht werden. Für jedes dieser Zielproteine, zu denen Alkoholdehydrogenasen, Hydrolasen und das humane Interferon 2αb-Protein zählen, konnte in Überexpresssionsversuchen und anschließenden Enzymnachweisen zum ersten Mal systematisch eine Kombination aus molekularen Chaperonen und Foldasen identifiziert werden, welche die Produktion katalytisch aktiver Moleküle deutlich erhöhte. Syntheses of recombinant proteins for applications in science or in industrial production processes have become more meaningful over the past few years. A wide variety of different expression systems have been constructed and optimized to allow the retrieval of a broad spectrum of target proteins. Usually, the Gram-negative bacterium Escherichia coli is most commonly used for heterologous expression of different target genes, as this bacterium is simple to handle and easy to manipulate genetically. Supported by this organism an explicit higher yield of proteins can be achieved compared to eukaryotic expression hosts. Nevertheless, several bottlenecks may appear during the heterologous synthesis of proteins, which can result in very small yields of the active protein. In addition, other factors like too high rates of expression, misfolding or instability of the target protein may lead to the formation of insoluble aggregates, so-called inclusion bodies. In several cases co-expression of genes of molecular chaperones or folding catalysts showed a yield improvement of the active protein. This process still is a trial-and-error approach as it is not predictable which modulator of the folding process or which combination of folding catalysts and molecular chaperones is required to optimize the synthesis of the recombinant protein. On this account an extensive chaperone gene expression library (toolbox) has been created during this thesis. Every gene that encodes a putative folding modulator of the versatile, Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa has been identified and cloned. Additionally, plasmids have been constructed by homologous recombination attempts containing three genes in randomized combinations of folding catalysts and molecular chaperones, respectively. Along the way and for the first time a vast number of different single and combined folding modulators were introduced into the bacterial hosts used for the production of problematically target proteins. By means of the generated chaperone-toolbox, the influence of single or combined folding modulators on the synthesis and activity of problematical target proteins has been investigated. By over-expression experiments and specific activity essays the protein yield and enzyme activity for proteins as alcohol dehydrogenases, hydrolases and the human Interferon 2αb protein has been determined. For each of these target proteins a combination of molecular chaperones and folding catalysts, which improved the production of catalytic active molecules significantly, has been identified systematically.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	03.01.2007
Dateien geändert am:	04.08.2008
Promotionsantrag am:	10.11.2006
Datum der Promotion:	10.11.2006