Dokument: Untersuchungen zur Rekonstruktion von c-Src-NS5A-NS5B sowie EDD E3-β-Catenin – zweier krankheitsrelevanter Proteinkomplexe

Titel:	Untersuchungen zur Rekonstruktion von c-Src-NS5A-NS5B sowie EDD E3-β-Catenin – zweier krankheitsrelevanter Proteinkomplexe
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=35890
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20151019-095301-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Valdau, Olga [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.10.2015 / geändert 07.10.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Bode, J. [Gutachter]
Stichwörter:	HCV, NS5A, NS5B, c-Src, EDD E3, beta-Catenin, wnt-Signalweg
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der Wissenschaftsgeschichte gingen die Forscher den Ursachen von Krankheiten immer tiefer auf den Grund. Heutzutage versucht man die molekularen Zellprozesse zu begreifen, um das Entstehen einzelner Krankheiten basierend auf verschiedenen Störungen bzw. Änderungen auf molekularer Ebene zu verstehen und darauf aufbauend neue Therapiestrategien zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von β-Catenin, einem Schlüsselprotein des Wnt-Signalweges, mit der UBA-Domäne der EDD E3 Ligase in vitro untersucht. Diese Interaktion gehört laut Zellkultur-Experimenten unserer Kooperationspartner zu einem neuartigen Regulationsmechanismus der β-Catenin Stabilität und steuert dadurch die Expression der Wnt-regulierten Gene, wie z.B. c-Myc und Cyclin D. Hier wurden in E. coli Expressions- und Reinigungsprotokolle für β-Catenin, UBA und Axin(435-541) etabliert, die eine schnelle Extraktion des rekombinanten Zielproteins in mg-Mengen erlauben. Zusätzlich wurden diverse Funktionalitäts-Assays zur Prüfung der präparierten Proteine konzipiert und mit Erfolg eingesetzt. Es konnte jedoch keine UBA-β-Catenin-Wechselwirkung in vitro detektiert werden. Dieser Befund deutet auf die in vivo Anwesenheit von regulierenden posttranslationalen Modifikationen hin. Somit sind die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen wegweisend für die zukünftige Erforschung der UBA-β-Catenin-Interaktion. In nachfolgenden Studien sollten die posttranslationalen Proteinmodifikationen und ihre regulierende Funktion analysiert werden. Im Weiteren wurde die Interaktion der humanen c-Src-Kinase mit den HCV Proteinen NS5A und NS5B untersucht. Durch die in Zellkultur (Huh9-13) beobachtete Assemblierung des heterotrimeren c-Src-NS5A-NS5B Komplexes wird c-Src den intrazellulären Signalkaskaden entzogen, wodurch diese auf pathogene Weise gestört werden. Im Verlauf dieser Arbeit konnten diverse c-Src-Konstrukte, Tyrosin-phosphoryliertes NS5A und NS5B Proteine in E. coli hergestellt und in mg-Mengen gereinigt werden. Im Rahmen der Arbeit entwickelte Kontrollbindungs-Assays belegten die Funktionalität der präparierten Proteine. Obwohl die Assemblierung des heterotrimeren Komplexes in vitro nicht erreicht werden konnte, stellt diese Arbeit eine gute Basis für die zukünftige Erforschung der HCV-Pathogenität dar. For years, researches have deepened our understanding of the causes of disease. Nowadays, scientists try to understand molecular processes in the cell in order to understand the origin of certain diseases associated with different disorders and changes on the molecular level. Using this information, new therapeutic approaches could be developed. In this work, the interaction of β-catenin, one of the key proteins in Wnt signaling pathway, with the UBA-domain of the EDD E3 ligase was studied in vitro. This interaction, according to the cell culture experiments of our cooperation partner, belongs to a new type of regulatory mechanisms for β-catenin stability and thus controls the expression of the Wnt signaling pathway genes, such as c-Myc or Cyclin D. Within this work, protocols for E. coli expression and purification of β-catenin, UBA and axin (431-541) were established allowing fast purification of recombinant protein in mg quantities. Additionally, functionality assays of the target proteins were developed and successfully used. No in vitro interaction between UBA and β-catenin was detected. This result suggests presence of regulatory posttranslational modifications in vivo. Hence, the studies presented in this work are crucial for future studies of the UBA/β-catenin interaction. In further experiments, posttranslational protein modifications and their regulatory effects should be analyzed. As well, the interaction of the human c-Src kinase with the HCV proteins NS5A and NS5B was studied. Due to the formation of the heterotrimeric c-Src-NS5A-NS5B-complex in hepatocellular carcinoma cells, c-Src is removed from the intracellular signal cascades and thus destructs them in a pathogenic way. Within this work different c-Src constructs, NS5B and tyrosine phosphorylated NS5A proteins were expressed in E. coli and purified in mg quantities. Control assays were established and successfully proved the functionality of those proteins. Although, the assembly of heterotrimeric complex was not demonstrated in vitro, those results are a good basis for future studies of HCV pathogenesis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	19.10.2015
Dateien geändert am:	19.10.2015
Promotionsantrag am:	25.11.2014
Datum der Promotion:	17.12.2014