Dokument: Biochemische und molekulare Charakterisierung der pflanzlichen TP-abhängigen Phosphofruktokinase aus Spinacia oleracea.

Titel:	Biochemische und molekulare Charakterisierung der pflanzlichen TP-abhängigen Phosphofruktokinase aus Spinacia oleracea.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3574
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101130-104454-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Winkler, Christian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,25 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Martin, William [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Stichwörter:	Phosphofruktokinase, ATP-PFK, PFK, Sequenz, Untereinheiten, SoPFK, Spinat, Spinacia oleracea, Reinigungphosphofructokinase, ATP-PFK, sequence, subunits, SoPFK, spinach, Spinacia oleracea, purification
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Obwohl ATP-PFK eines der bedeutensten Enzyme im pflanzlichen Stoffwechsel ist, sind bisher keine Sequenzdaten für dieses Enzym (ATP-PFK; EC 2.7.1.11) in Genbanken zugänglich. In dieser Arbeit wurde das Enzym 309fach bis zur vollständigen, elektrophoretischen Homogenität gereinigt. Die Reinigung wurde mit DEAE-Sepharose, S-400 Gelfiltration, einem Saccharose-Gradienten, Reactive-Red Affinitätschromatographie, Mono-Q Anionentauscher und Hydroxyl- apatit Chromatographie erreicht. Unter nativen Bedingungen liegt die gereinigte ATPPFK als Homotetramer vor, bestehend aus Unter- einheiten von ~52 kDa. Das Enzym katalysiert mit einer spezifischen Aktivität von 600 mU mg-1. Der Km-Wert für ATP wurde mit 81 µM bestimmt. Der Km-Wert für D-Fru-6-P liegt bei 1.7 mM. Die gereinigte PFK zeigte in der finalen Präparation keinerlei Aktivität mit Pyrophosphat (PPi) als Phosphoryldonor. Da die ATP-PFK durch Zugabe von ortho-Phosphat inaktiviert wurde, ist davon auszugehen, dass es sich hierbei um die plastidäre Isoform des Enzyms handelt [56]. Nach einer massenspektrokopischen Untersuchung des gereinigten Enzyms konnten insgesamt neun interne Peptidfragmente mikrosequenziert werden, aus deren Vorlage sich mittels geeigneter molekularbiologischer Techniken ein korrespondierender cDNA Klon (SoPFK1) erstellen ließ. Das Protein konnte heterolog immunologisch in einem PFK-defizienten Hefestamm detektiert werden; eine biochemische Aktivität ließ sich jedoch nicht messen. Obwohl eine in silico Analyse von SoPFK1 keinerlei Transit-Peptid prognostiziert, gruppiert es sich in einem phylogenetischen Netzwerk in der Gruppe II der vermutlichen plastidären PFKs (siehe Abb. 27). Zum Zeitpunkt dieser Arbeit wurden sämtliche möglichen PFK-Enzyme aus Pflanzen in der Genbank des NCBI (www.ncbi.nlm.nih,gov/) als PPi-abhängig vermutet. Hier konnte ersmals die Gensequenz für eine enzymatisch aktive ATP-PFK aus Pflanzen annotiert werden. Despite its importance in plant metabolism, no sequences of higher plant ATP-dependent phosphofructokinase (ATP-PFK; EC 2.7.1.11) are annotated in the databases. In this work the enzyme was purified from spinach leaves to electrophoretic homogeneity. The purification protocol included DEAE-Sepharose, Sephacryl S-400 gelfiltration, sucrose gradient, reactive-red dye affinity, Mono-Q and hydroxylapatite chromatography. The purified enzyme occured under native conditions in a homotetrameric conformation with subunits of ~52 kDa and a specific activity of 600 mU mg-1. The Km-value was determined as 81 µM for ATP and 1.7 mM for D-Fru-6-P respectively. The purified enzyme was not activated by ortho-phosphate, but slightly inhibited instead, suggesting that it was the chloroplast isoform [56]. The sequences of nine tryptic peptides from the final protein preparation, which did not accept pyrophosphate (PPi) as a phosphoryl donor, were determined and a corresponding cDNA was cloned (SoPFK1). Expression of SoPFK1 in PFK-deficient yeast cells yielded immunologically detectable protein but no detectable ATP-PFK activity. Despite of being absent of a predicted chloroplast transit peptide SoPFK1 clustered within the class of PFK sequences that have been designated as group II in phylogenetic network (sketched in Fig. 27), concluding that putative chloroplast PFKs were accumulating there. This sequence of enzymatically active spinach ATP-PFK suggests that a large family of genomics-derived higher plant sequences currently annotated in the databases as putative PPi-dependent PFK by the measure of sequence similarity is misannotated with respect to the cosubstrate.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	20.12.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	12.12.2006
Datum der Promotion:	12.12.2006