Dokument: Massenspektrometrische Identifizierung extrazellulär phosphorylierter endothelialer Membranproteine

Titel:	Massenspektrometrische Identifizierung extrazellulär phosphorylierter endothelialer Membranproteine
Weiterer Titel:	Identification of extracellularly phosphorylated endothelial membrane proteins by mass spectrometry
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=35732
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150929-101341-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Willberg, Wibke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.09.2015 / geändert 26.09.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Elvers, Margitta [Gutachter]
Stichwörter:	Membranproteine, Ektoproteinkinasen, Phosphoproteine, Endothel
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Um die Funktion von Ektoproteinkinasen in Hinblick auf ihre membranständigen Substrate näher aufzuklären zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Methoden entwickelt und evaluiert, mit denen extrazellulär phosphorylierte Membranproteine auf der Oberfläche von humanen umbilicalen Endothelzellen (HUVECs) und einer humanen Leukämiezelllinie (K562-Zellen) isoliert und massenspektrometrisch identifiziert werden konnten. Zum einen wurden extrazellulär phosphorylierte Membranproteine mit biotinylierten Antikörpern gegen phosphorylierte Aminosäuren markiert und anschließend mithilfe von Detergenzien aus der Zellmembran gelöst. Die markierten Phosphoproteine wurden daraufhin durch Ausnutzen der Biotin-Streptavidin-Bindung aus dem Überstand isoliert. Zum anderen wurden die extrazellulären Domänen sämtlicher Membranproteine von der Zelloberfläche proteolytisch mit Bromelain abgespalten. Anschließend wurden die Phosphopeptide mithilfe der Affinitätschromatographie (IMAC, Immobilized Metal Affinity Chromatography) aus dem Überstand isoliert. In beiden Methoden wurden die isolierten Peptide bzw. Proteine massenspektrometrisch identifiziert. Es konnten 4 extrazellulär phosphorylierte Membranproteine auf HUVECs (Notch 1, Otopetrin 1, Regulator of G-protein signalling 13, Protein tyrosine phosphatase receptor type D isoform 3) und 1 extrazellulär phosphoryliertes Membranprotein auf K562-Zellen (Usherin isoform B) identifiziert werden. To elucidate the function of ecto-protein kinases with regard to their membrane-bound substrates two methods were developed and evaluated in this work with which extracellularly phosphorylated membrane proteins on the surface of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and a human leucemia cell line (K562-Cells) could be isolated and identified by mass spectrometry. Firstly extracellularly phosphorylated membrane proteins were labeled with biotinylated antibodies against phosphorylated aminoacids and afterwards solubilized from the membrane by detergents. The labeled phosphoproteins were then isolated from the supernatant by utilization of the biotin-streptavidin-binding. Secondly the extracellular domains of all membrane proteins were cleaved proteolytically from the cell surface by bromelain. Afterwards the phosphopeptides were isolated from the supernatant by Immobilized Metal Affinity Chromatographie (IMAC). In both methods the isolated peptides resp. proteins were identified by mass spectrometry. 4 extracellularly phosphorylated membrane proteins on HUVECs (Notch 1, Otopetrin 1, Regulator of G-protein signalling 13, Protein tyrosine phosphatase receptor type D isoform 3) and 1 extracellularly phosphorylated membrane proteine on K562-cells (Usherin isoform B) could be identified.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	29.09.2015
Dateien geändert am:	29.09.2015
Promotionsantrag am:	10.12.2010
Datum der Promotion:	08.09.2015