Dokument: Massenspektrometrische Strukturuntersuchungen an Monomeren und Dimeren des Prion-Proteins

Titel:	Massenspektrometrische Strukturuntersuchungen an Monomeren und Dimeren des Prion-Proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3545
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101130-103215-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kaimann, Tina Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,93 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Dr. h.c. Höltje, Hans-Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Prion-Protein, Dimer, Crosslink, Massenspektrometrie, Protein-Protein-Wechselwirkungen, in-vitro-Konversionprion protein, dimer, crosslinking, mass spectrometry, protein-protein-interactions, in-vitro-conversion
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Unter dem Begriff Prion-Krankheiten, oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE), werden eine Reihe lethaler neurodegenerativer Krankheiten zusammengefasst. Die Erreger dieser Krankheiten, die Prionen, bestehen hauptsächlich, wenn nicht sogar ausschließlich, aus dem sogenannten Prion-Protein (PrP). Die aggregatbildende pathogene Isoform des Prion-Proteins (PrPSc) unterscheidet sich vom zellulären nicht infektiösen Prion-Protein (PrPC) u.a. in der Sekundärstruktur, so dass die Konformationsumwandlung des a-Helix-dominierten PrPC in das b-Faltblatt-dominierte PrPSc das entscheidende Ereignis in der Bildung von infektiösem PrPSc darstellt. Diese Umwandlung kann mittels eines in-vitro-Systems untersucht werden, bei dem in Abhängigkeit von submizellaren Konzentrationen von SDS der Strukturübergang von PrP induziert und Zwischenstufen eingestellt werden können. Mit Hilfe dieses Systems wurden als frühe stabile Intermediate des Übergangs und der Bildung amorpher Aggregate u.a. a-helikale Dimere gefunden, deren tatsächliche Tertiär- und Quartärstruktur bislang nicht geklärt ist. Um diesen initialen Schritt der Dimerbildung strukturell und mechanistisch aufzuklären, sollten die Dimere mit Hilfe des chemischen Crosslinkers EDC kovalent verbunden werden. Durch diese Reaktion werden inter- oder intramolekulare Isopeptidbindungen aus vorherigen Salzbrücken, also zwischen Lysin- und Aspartat- oder Glutamat-Seitenketten, erzeugt. In dieser Arbeit wurden diese neuen Isopeptidbindungen in PrP-Di- und -Monomeren mittels tryptischer Verdauung und anschließender massenspektrometrischer Analysen exakt bestimmt. In Monomeren und Dimeren konnten Crosslink-Positionen, sprich vorherige nicht-kovalente Interaktionen, zwischen dem bislang als flexibel betrachteten N-Terminus und drei sauren Aminosäuren im globulären Teil von PrP benannt werden. Analysen an dimeren Vorstufen der PrP-Fibrillogenese, die im in-vitro-System durch NaCl-Zugabe eingestellt wurden, zeigten identische Interaktionen zu den zuvor analysierten Dimeren mit dem Unterschied, dass die N-terminale Domäne sehr viel dynamischer war, zu erkennen an dem relativ geringen Vernetzungsgrad. Diese Flexibilität ist somit entscheidend für die Bildung amyloider Fibrillen. Anhand dieser Ergebnisse wurde durch molekulare Modellierung in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Höltje ein neues Strukturmodell speziell für die N-terminale Domäne in PrP-Monomeren und -Dimeren erstellt. Die Fibrillogenese von PrP wird anhand eines neuen Modells diskutiert, bei dem die N-terminale Region die als nativ betrachtete a-helikale Struktur stabilisiert und erst bei erhöhter Dynamik des N-Terminus die Umwandlung zu amyloiden b-strukturierten Fibrillen möglich wird. Prion diseases or transmissible spongiforme encephalopathies are lethal neurodegenerative diseases which can be of genetic, sporadic or infectious origin. The infectious agents of these diseases, namely prions, are composed largely, if not entirely, of the so called Prion Protein (PrP). The aggregated pathological isoform of the Prion Protein (PrPSc) differs from the cellular Prion Protein (PrPC) in its secondary structure. Therefore the conformational transition from the a-helikal PrPC into b-structured PrPSc is the fundamental event in the formation of infectious PrPSc. This transition can be studied in an in vitro system which utilizes submicellar concentrations of SDS to induce the structural conversion of PrP. Using this system stable intermediates in the formation of amorphous aggregates in form of a-helical dimers can be generated. The exact tertiary and quartenary structure of these dimers is still unclear. To resolve structurally and mechanistically this initial step of dimerization the dimers were covalently cross-linked using the chemical cross-linker EDC. In this reaction inter- and intramolecular isopeptide bonds of previously existing salt bridges, i.e. between lysine- and aspartate- or glutamate-residues, are generated. In this work the newly formed isopeptide bonds in PrP-dimers and -monomers were exactly determined using tryptic digestion and subsequent mass spectrometrical analysis. In monomers and dimers cross-linking positions, i.e. previous non-covalent interactions, between the so far considered as flexible N-terminus and three acidic aminoacids in the globular part of PrP were identified. The analysis of dimeric intermediates in amyloid fibril formation of the Prion Protein generated in the in-vitro-system by the addition of NaCl showed the same interaction sites as found in the dimers analysed before. However, under these conditions decreased cross-linking rates showed that the N-terminal domain is much more dynamic. This flexibility of the N-terminal domain is thus crucial for amyloid fibril formation. Based on these results using molecular modelling techniques, in cooperation with the group of Prof. Höltje, a new structural model for PrP-monomers and dimers was established. This model takes specifically the N-terminal domain into account. Amyloid fibril formation is discussed by means of a new model in which the N-terminal region stabilizes the a-helical structure and transition to amyloid fibrils is not possible until the N-terminus displays an increased dynamic.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	04.12.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	17.11.2006
Datum der Promotion:	17.11.2006