Dokument: Analyse des Mechanismus der Phosphatregulation in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Analyse des Mechanismus der Phosphatregulation in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3537
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101130-102851-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sorger-Herrmann, Ulrike [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Wendisch, Volker [Gutachter]
Stichwörter:	Phosphat, Phosphatmangelantwort, Regulation des pstSCAB-Operons, RamB, GlxR, CgtR4, Zweikomponentensystem PhoRSphosphate, phosphate starvation response, regulation of the pstSCAB operon, RamB, GlxR, CgtR4, two component system PhoRS
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Regulation des Phosphorstoffwechsels in Corynebacterium glutamicum charakterisiert. Es war bekannt, dass das Zweikomponentensystem PhoRS an dieser Regulation beteiligt ist, aber nicht essentiell für die Induktion des pstSCAB-Operons bei Phosphatmangel ist. Im Mittelpunkt stand daher die Identifizierung und Charakterisierung des/der PhoRS-unabhängigen Regulators/en des pstSCAB-Operons. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst überprüft, ob die Gene des Phosphatmangelstimulons einer Kontrolle durch mRNA-Abbau unterliegen. Dafür wurde zum ersten Mal die mRNA-Stabilität in C. glutamicum in einem genomweiten Ansatz untersucht. Die mRNA-Stabilität der Gene des Phosphatmangelstimulons entsprach mit einer durchschnittlichen mRNA-Halbwertszeit von 5 min der durchschnittlichen mRNA-Stabilität aller Gene des C. glutamicum-Genoms. Daraus lässt sich schließen, dass die Regulation der Phosphatmangelgene im Wesentlichen auf Ebene der Transkription und nicht durch Kontrolle des mRNA-Abbaus erfolgt. Die bisherigen Untersuchungen zu PhoRS waren auf die kurzfristige Antwort auf Phosphatmangel beschränkt. Die experimentellen Daten dieser Arbeit zeigten, dass PhoRS weder essentiell für das Wachstum unter Phosphatmangelbedingungen noch für das Wachstum auf den alternativen Phosphorquellen Adenosin-5’-Monophosphat, L-α-Glycerinphosphat und UDP-Glucose ist. Das verzögerte Wachstum nach einem Transfer in Phosphatmangelmedium und die verzögerte Induktion der Gene des Phoshphatmangelstimulons in Abwesenheit von PhoRS zeigen allerdings, dass PhoRS wichtig für die schnelle Anpassung an Phosphatmangel ist. Durch Deletionsanalyse des pstS-Promotors aus C. glutamicum konnte die Binderegion eingegrenzt werden. Diese befindet sich in einem 35 bp langen Bereich, -217 bis -182 stromaufwärts vom Transkriptionsstart. Mit Hilfe der DNA-Affinitätschromatographie und MALDI-TOF Massenspektrometrie wurden die Regulatoren des Acetatstoffwechsels RamB und GlxR sowie der Antwortregulator CgtR4 als an den pstS-Promotor bindende Proteine identifiziert. RamB und CgtR4 interagierten sowohl auf Glucose-Medium unter ausreichender Phosphatkonzentration als auch auf Acetat-Medium unter Phosphatmangel mit dem pstS-Promotor, während GlxR nur auf Acetat-Medium bei Phosphatmangel an den pstS-Promotor band. In Gelretardierungsexperimenten wurde nachgewiesen, dass gereinigtes GlxR-Protein in vitro mit einer hohen Affinität an den pstS-Promotor bindet. Die Bindung von GlxR an den pstS-Promotor erfolgte dabei nur in Anwesenheit von cAMP. GlxR bindet an eine 255 bp lange Region des pstS-Promotors, die sich von –129 bis +126 bezogen auf den Transkriptionsstart erstreckt. Basierend auf dem kürzlich identifizierten RamB-Bindemotiv, 5’-AA/GAACTTTGCAAA-3’, gelang es bei einer genaueren bioinformatischen Analyse der pstS-Promotorregion zwei nicht vollständig konservierte RamB-Bindemotive zu identifizieren. In Gelretardierungsexperimenten mit verschiedenen Teilfragmenten des pstS-Promotors und durch Mutation der Bindemotive konnte experimentell gezeigt werden, dass beide Bindemotive an der Interaktion von RamB mit dem pstS-Promotor beteiligt sind. Aus Transkriptionsfusionsanalysen ließ sich ableiten, dass der Regulator RamB den pstS-Promotor bei einem Transfer von phosphathaltigem Glucose-Medium zu phosphatfreien Glucose-Medium in vivo aktiviert, während RamB die Transkription des pstS-Promotors bei einem Transfer von phosphathaltigem Acetat-Medium zu phosphatfreien Acetat-Medium reprimiert. Außerdem wurde sowohl in Transkriptionsfusionsanalysen als auch in Transkriptomanalysen gezeigt, dass die Phosphatmangelinduktion des pstSCAB-Operons von der Kohlenstoffquelle abhängt. Die Gene des Phosphatmangelstimulons wiesen nach dem Transfer von Glucose-Medium auf phosphatfreies Glucose-Medium eine stärkere Induktion auf als nach dem Transfer von Acetat-Medium auf phosphatfreies Acetat-Medium. Die im Vergleich zu phosphatfreiem Acetat-Medium höhere Expression der Gene des Zweikomponentensystem PhoRS auf phosphatfreiem Glucose-Medium lässt in Verbindung mit einer durch bioinformatische Analysen identifizierten möglichen RamA-Bindestelle vermuten, dass die Expression der Gene des Zweikomponentensystems PhoRS nach Wachstum auf Glucose durch RamA aktiviert wird. Damit wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt, dass in C. glutamicum über die Kohlenstoffregulatoren RamA, RamB und GlxR eine Verbindung zwischen der Regulation von Kohlenstoff- und Phosphorstoffwechsel besteht. In this work the regulation mechanism of the phosphor metabolism in C. glutamicum was characterized. It was based on the knowledge that the two-component regulatory system PhoRS is involved in this regulation, but it is not essential for the induction of the pstSCAB operon, which encodes a high-affinity uptake system for phosphate, upon phosphate starvation. Consequently, the goal was to characterize the PhoRS independent regulation of the pstSCAB operon. Initially, it was determined whether the phosphate starvation inducible genes are controlled by mRNA degradation. For the first time mRNA stability experiments were performed in C. glutamicum. In terms of mRNA stability, the genes of the phosphate starvation stimulon did not differ from all other genes of the C. glutamicum genome and showed an average mRNA half life of 5 min. Thus, the regulation of the phosphate starvation inducible genes primarily occurs on the transcriptional level and not by mRNA degradation. A detailed analysis of the long-term effects of PhoRS on the regulation of phosphor metabolism genes revealed that PhoRS is neither essential for growth under phosphate starvation conditions nor for growth with 5’adenosine monophosphate, L-α-glycerinphosphate or UDP-glucose as alternative sources of phosphorus. However, the delayed induction of the genes of the phosphate starvation stimulon observed in the absence of PhoRS showed its importance for the fast adaption to phosphate starvation. The binding region of PhoR, which is located in a 35 bp long region, -217 to -182 bp upstream of the transcriptional start, could be determined employing deletion analysis of the pstS promoter. By DNA affinity chromatography and MALDI-MS analysis the transcriptional regulators of acetate metabolism RamB and GlxR as well as of the uncharacterized response regulator CgtR4 could be identified as proteins binding to the pstS promotor. RamB and CgtR4 interacted with the pstS promoter after cultivation on glucose medium under phosphate excess as well as on acetate medium under phosphate limiting conditions. However, binding of GlxR could only be detected after cultivation on acetate medium upon phosphate starvation. In electro mobility shift assays purified GlxR bound to the pstS promoter in vitro with high affinity. Binding of GlxR to the pstS promoter was only detected in the presence of cAMP. The binding region of GlxR is located in a region of the pstS promoter ranging from bp –129 to bp +126 related to the transcriptional start site. Based on the known RamB binding motif, 5’-AA/GAACTTTGCAAA-3’, two incompletely conserved RamB binding motifs could be identified in the pstS promoter. In electro mobility shift assays with different fragments of the pstS promoter and with fragments carrying mutated binding motifs it could be shown that both binding motifs are necessary for the interaction of RamB with the pstS promoter. Transcriptional fusion analyses revealed that the regulator RamB activates the pstS promoter after a shift from phosphate-containing to phosphate-free glucose medium in vivo. However, RamB represses the pstS promoter after a shift from phosphate-containing to phosphate-free acetate medium. In addition, transcriptional fusion analyses and transcriptome analyses revealed that the induction level of the pstSCAB operon upon phosphate starvation depends on the carbon source. The induction of the pstSCAB operon after a shift from phosphate-containing to phosphate-free medium was higher with glucose as carbon source than with acetate as carbon source. These results and the observations that the genes of the two component system PhoRS showed a higher expression on phosphate-free glucose medium than on phosphate-free acetate medium and that a potential RamA binding site could be identified upstream of the phoRS operon by bioinformatical analysis revel link between phosphate- and carbon-dependent regulation of genes of the phosphorus metabolism. Thus, this work for the first time shows that the regulation of carbon and phosphor metabolism is connected by the carbon regulators RamA, RamB and GlxR.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	29.11.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	02.11.2006
Datum der Promotion:	02.11.2006