Dokument: Nichtgenomische Effekte von Östrogenen in östrogensensitiven Mammakarzinomzellen
| Titel: | Nichtgenomische Effekte von Östrogenen in östrogensensitiven Mammakarzinomzellen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3525 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20101130-102502-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Heimerzheim, Torsten [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Dall, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Östrogen, Östradiol, Östrogen-Rezeptor, ER, MCF-7, Nichtgenomische, Brustkrebs, MAPK, MAP-Kinase, Erkestrogen, estradiol, estrogen receptor, ER, MCF-7, nongenomic, breast cancer, MAPK, map kinase, erk | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das Steroidhormon Östrogen entfaltet nach der klassischen Lehrmeinung genomische Wirkungen über die Interaktion mit dem intrazellulären Östrogenrezeptor (ER), was in einer modifizierten Expression spezifischer Gene im Zellkern resultiert. Neuere Befunde weisen zunehmend darauf hin, dass Östrogene auch schnelle, membranvermittelte, als nichtgenomisch bezeichnete Wirkungen innerhalb weniger Minuten hervorrufen können. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von Östrogenen sowie Antiöstrogenen auf die nichtgenomische Aktivierung des MAPK-Signalweges in Brustkrebszellen sowie der möglichen Beteiligung des klassischen Östrogenrezeptors ERalpha an diesen Wirkungen. In allen Experimenten wurde die ER-positive Zelllinie MCF-7 verwendet. Mit Hilfe des MTS-Proliferationsassays wurden diese Zellen positiv auf östrogenresponsives Wachstum hin getestet. Auf eine 5-minütige Stimulation mit 17beta-Östradiol (E2) sowie dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF als Positivkontrolle antworteten diese Zellen laut Analyse per SDS-PAGE und Western-Blot mit einer deutlichen Aktivierung der MAPK Erk1/2. Die Aktivierung bei längeren Stimulationen mit E2 nahm stark ab. Das Ausmaß einer vorhandenen Basisaktivierung der MAPK ohne Zugabe eines externen Stimulanzes konnte auf intrazellulär gebildetes E2 sowie E2-Restmengen im fötalen Kälberserum des Zellkulturmediums zurückgeführt werden. Die schnelle MAPK-Aktivierung durch E2 war mit dem MEK-Inhibitor PD 98,059 vollständig blockierbar. Die Antiöstrogene ICI 182,780, Tamoxifen und Raloxifen (Blocker für den intrazellulären ER) konnten die E2-vermittelte MAPK-Aktivierung aufheben, was für die Notwendigkeit des klassischen ER in der Vermittlung dieser membrannahen Signalwirkung spricht. Das membranimpermeable Konjugat E2-BSA ist ein Hilfsmittel, membranvermittelte E2-Wirkungen zu charakterisieren. Die 5-minütige Stimulation der Zellen mit dem Konjugat als auch dessen Filtrat führte zu einer deutlichen MAPK-Aktivierung. Diese Aktivierung konnte somit nicht eindeutig auf das extrazellulär vorhandene Konjugat zurückgeführt werden und wurde möglicherweise durch dissoziiertes E2 ausgelöst. Eine nähere Untersuchung auf Dissoziationseffekte wurde durch Expressionsanalyse des östrogenabhängig exprimierten Gens Cathepsin D mittels RT-PCR vorgenommen. Die vergleichende Inkubation der Zellen mit E2 und E2-BSA für 0-24 h zeigte für beide Substanzen eine ähnlich erhöhte relative Genexpression für Cathepsin D. Die erhöhte Cathepsin D Expression durch E2-BSA deutet auf die genomische Wirksamkeit von dissoziiertem E2 hin, was den Einsatz von E2-BSA zur Untersuchung extrazellulär ausgelöster, nichtgenomischer Effekte in Frage stellt. Die molekulare Struktur membrannaher bzw. intramembranärer Rezeptoren für E2 ist noch nicht ausreichend aufgeklärt, jedoch konnten durch die Inkubation von intakten MCF-7 Zellen mit dem fluoreszenzmarkierten Konjugat E2-BSA-FITC mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) spezifische Bindungsstellen für E2 an der Plasmamembran (PM) dargestellt werden. Die Behandlung der Zellen mit Antikörpern gegen den klassischen ER konnte keinen Nachweis der extrazellulären Zugänglichkeit dieses Rezeptors erbringen. Eine künstliche Erhöhung der intrazellulären Menge des klassischen Östrogenrezeptors ERalpha in MCF-7 Zellen wurde durch stabile Transfektion mit Hilfe eines retroviralen Expressionsvektors erreicht. Die Transfektion der Zellen führte zu einer gesteigerten Aktivierung der MAPK Erk1/2 nach 5-minütiger E2-Stimulation. Da nur der an der PM lokalisierte ER-Anteil für die Weiterleitung nichtgenomischer Signale relevant ist, weist die durch Überexpression des ER hervorgerufene Veränderung auf dessen Beteiligung an der schnellen, E2-vermittelten MAPK-Aktivierung hin und zeigt die Beeinflussbarkeit dieser Wirkungen auf.According to the prevailing view, the steroid hormone estrogen unfolds genomic actions through interaction with the intracellular estrogen receptor (ER) resulting in a modified expression of specific genes in the nucleus. Recent reports point out that estrogens also cause rapid membrane-mediated so-called nongenomic effects within a few minutes. This study was aimed at investigating the influences of estrogens and antiestrogens on the nongenomic activation of the MAPK signalling pathway in breast cancer cells as well as the possible involvement of the classical estrogen receptor ERalpha in these actions. The ER positive cell line MCF-7 was used in all experiments. These cells were tested positive for estrogen responsive cell growth using the MTS proliferation assay. Cell stimulation for 5 minutes with 17beta-estradiol (E2) and epidermal growth factor (EGF) as a positive control led to a distinct activation of MAPKs Erk1/2 in these cells according to SDS-PAGE and Western blot analysis. The activation decreased strongly when stimulation periods were extended. The degree of a present basal MAPK activation without adding an external stimulant was ascribed to intracellularly generated E2 as well as remaining quantities of E2 in the fetal calf serum included in the cell culture medium. The rapid MAPK activation mediated through E2 was completely blocked with the MEK inhibitor PD 98,059. Antiestrogens ICI 182,780, tamoxifen and raloxifene (intracellular ER blockers) were able to eliminate the E2 mediated MAPK activation. This speaks for the necessity of the classical ER in mediating these membrane-located signalling processes. The membrane-impermeable conjugate E2-BSA is a helpful tool for characterizing membrane-mediated E2 actions. Cell stimulation with this conjugate and even with its filtrate for 5 minutes led to a distinct MAPK activation. Therefore this activation could not be clearly ascribed to the extracellularly located conjugate and was possibly elicited through dissociated E2. The effects of dissociation were investigated more detailed via expression analysis of the estrogen-dependent expressed gene Cathepsin D by using RT-PCR. The comparing incubation of cells with E2 and E2-BSA for 0-24 h revealed a similarly increased relative gene expression of Cathepsin D for both substances. The increased expression of Cathepsin D caused by E2-BSA indicates genomic action of dissociated E2, thus questioning the usage of E2-BSA in investigations aimed at extracellularly elicited nongenomic effects. Although the molecular structure of near- or intra-membrane E2 receptors is not sufficiently characterized the incubation of intact MCF-7 cells with the fluorescent ligand E2-BSA-FITC allowed the detection of specific surface binding sites on the plasma membrane (PM) using confocal laser scanning microscopy (CLSM). The treatment of cells with antibodies directed against the classical ERalpha did not provide evidence for the extracellular accessibility of these receptors. The artificial increase of the intracellular abundance of the classical receptor ERalpha was accomplished through stable transfection of MCF-7 cells using a retroviral expression vector. The transfection of cells led to an increased MAPK Erk1/2 activation after 5 minute cell stimulation with E2. Given that only the PM located fraction of ER is relevant to nongenomic signalling, the ER overexpression-caused changes point out the involvement of ER in rapid E2-mediated MAPK activation and show the interference of these effects. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.11.2006 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 17.11.2006 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.11.2006 |
