Dokument: Energie- und Redoxstoffwechsel von Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Energie- und Redoxstoffwechsel von Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3490 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20060915-001490-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kabus, Armin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Weiss, Hanns [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | , Atmungskette, Bioenergetik, Cytochrom-1-3-Superkomplex, Cytochrom--Oxidase, F1FO-ATP-Synthase,Oxidative Phosphorylierung, Substratstufenphoshporylierung, Transhydrogenase, L-Lysin | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | In dieser Arbeit wurden drei Aspekte des Energie- und Redoxstoffwechels von Corynebacterium glutamicum untersucht, einem aeroben, Gram-positiven Bodenbakterium, das zur industriellen Aminosäureproduktion, insbesondere dem Geschmacksverstärker L-Glutamat (1,5 Millionen Tonnen pro Jahr) und dem Futtermitteladditiv L-Lysin (0,8 Millionen Tonnen pro Jahr), genutzt wird. Im ersten Teil wurde die Rolle der terminalen Cytochrom-bd-Oxidase für das Wachstum und die Lysin-Produktion untersucht. Bisherige Untersuchungen deuteten daraufhin, dass im Wildtyp ATCC13032 in erster Linie der Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex den Elektronentransfer zu Sauerstoff katalysiert und die Cytochrom-bd-Oxidase von untergeordneter Bedeutung ist. Demgegenüber konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Deletion der bd-Oxidase-Gene cydAB im Stamm 13032 ab der spätexponentiellen Phase zu einem starken Wachstumsdefekt führte. In den Lysin-Produktionsstämmen MH20-22B und DM1730 hatte die cydAB-Deletion keinen großen Einfluss auf das Wachstum, führte aber zu einer Steigerung der Lysinproduktion um etwa 10 %, und zwar vermutlich aufgrund eines reduzierten Glucose-Bedarfs für den Energie- und Erhaltungsstoffwechsel. Die unterschiedlichen Effekte der cyd-Deletion auf das Wachstum der Stämme könnten auf unterschiedlichen Wachstumsraten und dem unterschiedlichen ATP-Bedarf für Biomassebildung und Lysinbildung beruhen. Die Überproduktion einer aktiven Cytochrom-bd-Oxidase, die durch einen erhöhten Cytochrom-d-Gehalt und erhöhte Sauerstoffverbrauchsraten verifiziert wurde, hatte in allen o.g. Stämmen einen negativen Einfluss auf die Wachstumsrate und die Biomassebildung, während der Einfluss auf die Lysinbildung stammspezifisch variierte. Das reduzierte Wachstum kann durch eine verstärkte Nutzung des bd-Oxidase-Zweigs der Atmungskette und eine damit einhergehende Reduktion des P/O-Quotienten erklärt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Stämme konstruiert und charaktersiert, die aufgrund fehlender F1FO-ATP-Synthase-Gene (atpBEFHAGDC) ATP nur noch über Substratstufenphosphorylierung bilden können. Die Stämme zeigten erwartungsgemäß stark reduzierte Wachstumsraten und Zellausbeuten und bildeten z.T. hohe Konzentrationen an Acetat, was auf eine Limitierung des Kohlenstoffflusses durch den Citrat-Zyklus hindeutet. Die Deletion der FO-Gene (atpBEF) im Stamm DM1730 führte zu einer deutlich reduzierten Lysinbildung, stattdessen wurden aber signifikante Mengen an Alanin gebildet. Im dritten Teil der Arbeit wurde versucht, die für die Lysinbildung kritische NADPH-Verfügbarkeit durch Überproduktion der membrangebundenen Transhydrogenase PntAB aus Escherichia coli in C. glutamicum DM1730 zu verbessern. PntAB nutzt das elektrochemische Protonenpotential, um NADP+ mit NADH zu reduzieren. Es konnte gezeigt werden, dass der rekombinante Stamm mit einer Transhydrogenase-Aktivität von ca. 0,6 U/mg bei Wachstum auf Glucose 18 % mehr Lysin bildete als der Referenzstamm ohne diese Aktivität. Die PntAB-Überproduktion stellt somit eine neue metabolic engineering Strategie zur Verbesserung der L-Lysin Produktion durch C. glutamicum dar.In this work three different aspects of the energy and redox metabolism of the aerobic Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum were investigated. This species is used industrially for the large-scale production of amino acids, in particular the flavour-enhancer L-glutamate (1.5 million tons per year) and the feed-additive L-lysine (0.8 million tons per year). In the main part of the work, the role of cytochrome bd oxidase for growth and lysine production was analysed. Previous investigations suggested that electron transfer to oxygen by the wild type ATCC 13032 is mainly catalysed by the cytochrome bc1-aa3 supercomplex and that cytochrome bd oxidase is of minor importance. In the current work it could be shown, however, that the deletion of the cytochrome bd oxidase genes cydAB in strain 13032 led to a drastic growth defect, starting in the late exponential growth phase. In the lysine-producing strains MH20-22B and DM1730, deletion of the cydAB genes had only minor effects on growth, but lysine formation was increased by approximately 10 %, which is probably due to a reduced glucose demand for energy generation and maintenance. Thus, the respiratory chain was shown to be a target for metabolic engineering. The different effects of the cydAB deletion on growth might result from different growth rates and different ATP requirements for biomass and lysine formation. Overproduction of an active cytochrome bd oxidase, which was verified by an increased cytochrome d content and increased oxygen consumption rates, led to reduced growth rates and reduced biomass formation of all strains mentioned above, whereas lysine production varied strain-specifically. The negative effect of bd overproduction on growth might be explained by a reduced P/O ratio due to an increased electron flow through the bd branch of the respiratory chain. In a second part of this work, C. glutamicum strains lacking the F1FO-ATP synthase genes (atpBEFHAGDC) were constructed and characterised. These mutants can form ATP only via substrate-level phosphorylation and, as expected, showed strongly reduced growth rates and cell yields on glucose minimal medium. Furthermore, they formed large amounts of acetate, indicating a limitation of the carbon flux through the tricarboxylic acid cycle. Deletion of the FO genes (atpBFE) in strain DM1730 led to a significant decrease in lysine formation, but caused the excretion of alanine. In the third part of this work, the membrane-integral transhydrogenase PntAB from Escherichia coli was overproduced in C. glutamicum DM1730 in order to improve the NADPH availability, which is critical for lysine formation. PntAB uses the electrochemical proton potential to reduce NADP+ with NADH. During growth on glucose, the recombinant strain with a transhydrogenase activity of 0.6 µmol min-1 (mg protein)-1 formed 18 % more lysine than the parental strain lacking PntAB. Thus, overproduction of PntAB represents a novel metabolic engineering strategy to improve L-lysine production by C. glutamicum. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 15.09.2006 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.04.2006 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.04.2006 |
