Dokument: Funktionelle Charakterisierung der Chlamydia pneumoniae Effektorproteine CPn0809 und CPn0147

Titel:	Funktionelle Charakterisierung der Chlamydia pneumoniae Effektorproteine CPn0809 und CPn0147
Weiterer Titel:	Functional characterization of the Chlamydia pneumoniae effector proteins CPn0809 and CPn0147
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34739
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150709-105945-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Engel, Astrid Corinna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 40,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.07.2015 / geändert 09.07.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	CPn0809, Chlamydia pneumoniae, T3SS
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydia pneumoniae ist ein obligat intrazelluläres, gramnegatives Bakterium, das mit akuten und chronischen Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege in Verbindung gebracht wird. Chlamydien weisen einen einzigartigen, biphasischen Lebenszyklus auf, der sich durch den Wechsel zwischen zwei Zellformen auszeichnet: den gegen extrazelluläre Einflüsse stabilen und infektiösen Elementarkörperchen (EBs) und den intrazellulären, metabolisch aktiven Retikularkörperchen (RBs). Während der intrazellulären Phase der Infektion verbleiben die Bakterien in einer Vakuole, die als Inklusion bezeichnet wird. Zur Etablierung und Erhaltung dieser Nische modulieren die Bakterien die Wirtszelle auf vielfältige Weise durch sogenannte Effektorproteine. Viele dieser Effektoren werden durch einen Multiprotein-Komplex in die Wirtszelle transportiert, der als Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) bezeichnet wird. Zur Überbrückung der Plasmamembran der Zielzelle wird das Translokon, ein heterooligomerer Komplex aus drei Proteinen, an der Nadelspitze des T3SS aufgebaut. Durch die Expression einer genomischen C. pneumoniae Bibliothek im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae, in welchem grundlegende eukaryotische Strukturen und Mechanismen konserviert sind, waren in unserem Labor mögliche neue Effektoren identifiziert worden. Dabei war gezielt nach Proteinen gesucht worden, die einen Wachstumsdefekt auslösen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die beiden putativen Effektoren mit den Bezeichnungen CPn0147 und CPn0809 zu charakterisieren. Durch bioinformatische Analysen wurden in CPn0809 Strukturmerkmale von hydrophoben Translokationsporen-Proteinen des T3SS identifiziert. Kofärbungen des CPn0809 mit dem C. pneumoniae Lipopolysaccharid oder dem intra-chlamydialen Chaperon DnaK zeigten, dass CPn0809 während der Adhäsion und Internalisierung mit EBs assoziiert ist. Durch Behandlung mit PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) wird eine distinkte Menge des CPn0809 von infektiösen EBs gelöst. Die leichte Zugänglichkeit des CPn0809 könnte auf eine Assoziation mit der Sekretionsmaschinerie des T3SS hindeuten. Zudem wies CPn0809 in Interaktionsstudien funktionelle Charakteristika bereits untersuchter Translokationsporen- Proteine anderer pathogener Bakterien auf, wie Selbstinteraktion und die Interaktion mit dem T3SS-assoziierten C. pneumoniae Chaperon CPn0811 (LcrH_1). Bei der heterologen Expression in Escherichia coli zeigte sich, dass die Expression von CPn0809 zur Lyse der Zellen führt, was als Hinweis auf eine Porenbildung interpretiert wurde. Zudem zeigte der C- Terminus des CPn0809 eine Affinität zu bestimmten Phospholipiden, die auf der zytosolischen Seite der Wirtszellmembran an der Eintrittsstelle der EBs lokalisiert sein könnten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CPn0809 eines der C. pneumoniae Translokon-Proteine ist. Das C. pneumoniae Protein CPn0147 war als Inklusionsmembran-Protein (Inc) charakterisiert worden, welches in der Inklusionsmembran und auf fädigen Strukturen im Wirtszellzytosol lokalisiert. Die Lokalisationsanalyse verschiedener Marker von Wirtszellorganellen zeigte, dass die CPn0147-positiven Fäden eine membranöse Identität aufweisen. Interessanterweise generiert CPn0147 nach Transfektion in der Humanzelle selbst fädige Strukturen, die ebenfalls mit verschiedenen Membranmarkern kolokalisieren. Die CPn0147-Fäden der Infektion sowie der Transfektion waren mit Rab11, einem Marker für Recycling-Endosomen, assoziiert. Zudem zeigte die Kotransfektion von CPn0147 und STIM-1, einem Protein, das die Interaktion des Endoplasmatischen Retikulums (ER) mit Mikrotubuli vermittelt, eine Verbindung der CPn0147-Fäden mit dem ER. Weitere Färbungen zeigten keine eindeutige Assoziation der Fäden mit dem Zytoskelett der infizierten Zelle. Allerdings ist das Mikrotubuli-Zytoskelett für die Bildung von CPn0147-positiven Fäden in der Infektion essenziell, wie durch Behandlung infizierter Zellen mit der Mikrotubuli-depolymerisierenden Chemikalie Nocodazol gezeigt wurde. Auch die Behandlung mit Brefeldin A bewirkte eine starke Reduktion der Fadenzahl. Brefeldin A inhibiert die Exozytose durch Blockierung des anterograden Transports vom ER zum Golgi-Apparat und Induktion des retrograden Transports von Membranmaterial des Golgi-Apparates zum ER, was zu einer Akkumulation von Proteinen im ER und somit zu ER-Stress führt. Ein Hinweis darauf, dass nicht die Blockierung der Exozytose die Bildung der CPn0147-Fäden reduziert, sondern die Induktion von ER-Stress eine entscheidende Rolle spielt, gab die Wirkung von Ölsäure auf Brefeldin A behandelte Zellen, die hiernach ebenso viele CPn0147-Fäden aufwiesen wie nicht behandelte Zellen. Ölsäure fördert die Bildung von Lipidtröpfchen, Lipid-Speicherorganellen der Humanzelle, die vom ER gebildet werden und mit der Regulation von ER-Stress und der Degradation von Proteinen in Zusammenhang gebracht werden. Die Beobachtung, dass die Fäden mit Lipidtröpfchen und Rab11-Vesikeln assoziiert sind und wahrscheinlich mit dem ER in engem Kontakt stehen, deutet auf eine Funktion der Fäden bei der Interaktion mit Wirtszellorganellen hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei für die Infektion von C. pneumoniae wichtige Proteine untersucht. CPn0809 ist ein Teil der T3SS-Translokationspore und spielt eine wichtige Rolle bei der Sekretion von Effektorproteinen in das Zytosol der Wirtszelle zu Beginn und in den ersten Stunden der Infektion. CPn0147 moduliert die Topologie von Membranen und ist möglicherweise an der Bildung von membranösen Fäden beteiligt, die die Oberfläche der Inklusionsmembran vergrößern. Chlamydia pneumoniae is an obligate intracellular, Gram-negative bacterium, which is linked to acute and chronic diseases of the upper and lower respiratory tract. Chlamydia show an unique biphasic life cycle, during which they differentiate between two distinct forms: the infectious elementary bodies (EBs) adapted to survive in the hostile extracellular environment and the intracellular, metabolically active reticulate bodies (RBs). During the intracellular phase of the infection cycle the bacteria reside within a membrane bound vacuole called the inclusion. To establish and maintain this intracellular niche the bacteria modulate the host cell via so-called effector proteins. Many of these effectors are translocated by a multi-protein complex, which is called the Type-III-Secretion System (T3SS). The translocon, a hetero- oligomeric complex of three proteins, is located at the top of the T3SS needle and spans the host plasma membrane. In our lab new potential effector proteins had been identified by expressing a shot gun library of the C. pneumoniae genome in the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae, in which eukaryotic structures and mechanisms are conserved. Potential candidates were identified by screening for proteins that caused a growth defect phenotype. The aim of this study was to further investigate the function of the two putative effector proteins CPn0147 and CPn0809. Bioinformatic analyses revealed that CPn0809 harbors structural features of known hydrophobic translocation pore proteins of the T3SS. Co-staining of the C. pneumoniae lipopolysaccharide or the intra-chlamydial chaperone DnaK shows that CPn0809 is associated with the EBs during adhesion and internalization. Treatment of infectious EBs with PBS (phosphate buffered saline) removed a distinct portion of CPn0809. This demonstrates the easy accessibility of CPn0809 and is a hint for an association with the secretion machinery of the T3SS. Moreover, in interaction studies CPn0809 shows functional characteristics of known translocon proteins of other pathogenic bacteria, for example the ability to self-interact and interaction with the T3SS-associated chaperone CPn0811 (LcrH_1). The heterologous expression of CPn0809 in Escherichia coli causes cell lysis, which was interpreted as a hint for pore formation in an E. coli membrane. Additionally, the C-terminus of the protein shows affinity to specific phospholipids that are possibly part of the cytosolic face of the host cell membrane at the entry side of EBs. It is likely that CPn0809 is one of the C. pneumoniae translocon-proteins. The C. pneumoniae protein CPn0147 had been identified as an inclusion membrane protein (Inc), which is located in the inclusion membrane and also on fibers spanning the host cell cytosol. The analysis of the localization of different host cell organelle markers revealed a membranous identity of the CPn0147-positive fibers. Remarkably, transfected CPn0147 showed the ability to generate fibers in human cells on its own and these fibers also co- localized with membrane markers. CPn0147-fibers in infection and transfection associated with the recycling endosome marker Rab11. Furthermore, co-transfection of CPn0147 and STIM-1, a protein that mediates interaction of the endoplasmic reticulum (ER) with microtubules, suggested an interaction of CPn0147-fibers with the ER. Additional stainings revealed no clear connection of the fibers with the cytoskeleton of the infected cell. However, treatment of infected cells with the microtubule depolymerizing drug nocodazole demonstrated an essential role of the microtubule cytoskeleton for CPn0147-fiber formation. The treatment of infected cells with the drug Brefeldin A also causes a severe reduction of the fiber count. Brefeldin A inhibits exocytosis by blocking the anterograde transport from the ER to the Golgi apparatus and induces retrograde transport of membrane material of the Golgi apparatus to the ER, which leads to accumulation of proteins in the ER and thus causes ER- stress. Addition of oleic acid reversed the inhibiting effect of Brefeldin A on CPn0147-fiber formation, which is a hint that not blocking of exocytosis but ER-stress causes the reduction of fibers. Oleic acid is known to stimulate the production of lipid droplets, lipid-storage organelles of the human cell, which are produced at the ER and have been connected with the regulation of ER-stress and protein degradation. The associations of CPn0147-fibers with lipid droplets and Rab11-vesicles as well as the close contact with the ER indicate a function in interaction with different host cell organelles. Within the scope of this work two important proteins for C. pneumoniae infection were examined. CPn0809 likely is a part of the T3SS translocon and plays a role in the secretion of effector proteins into the host cell cytosol at the beginning and first hours of the infection. CPn0147 is able to modulate membrane topologies and could be involved in the production of membraneous fibers that possibly contribute to an enlargement of the inclusion membrane surface.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	09.07.2015
Dateien geändert am:	09.07.2015
Promotionsantrag am:	08.05.2015
Datum der Promotion:	19.06.2015