Dokument: Mechanismen der Msb2-vermittelten Virulenz des humanpathogenen Pilzes Candida albicans

Titel:	Mechanismen der Msb2-vermittelten Virulenz des humanpathogenen Pilzes Candida albicans
Weiterer Titel:	Msb2-mediated virulence mechanisms of the human fungal pathogen Candida albicans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=34616
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150619-102144-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Swidergall, Marc [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 100,40 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.06.2015 / geändert 18.06.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] PD Dr. Fleig, Ursula [Gutachter]
Stichwörter:	Candida albicans, antimikrobielle Peptide, Msb2
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der fakultativ humanpathogene Pilz Candida albicans hat die Fähigkeit, sich an wechselnde Bedingungen im menschlichen Wirt anzupassen. Das Sensorprotein Msb2 in der Plasmamembran erkennt Veränderungen in der Pilzzellwand und reguliert daraufhin die Zellmorphogenese, Zellwandbiogenese und Stressresistenz über den Cek1 „mitogen-activated protein kinase“ (MAPK)-Signalweg. Hierdurch kompensiert der Pathogen Defekte, die durch die Aktivitäten des menschlichen Immunsystems verursacht werden. C. albicans-Stämme, die eine zweifach Epitop-markierte Msb2-Variante produzieren, sekretierten die große N-terminale extrazelluläre Domäne quantitativ ins Medium, während die kleine C-terminale cytoplasmatische Domäne in der Zelle verblieb. Die sezernierte Exodomäne wurde durch die Protein-Mannosyltransferasen Pmt1 und Pmt2 hoch O-glykosyliert und erhielt eine molekulare Masse von > 400 kDa. Die proteolytische Spaltung des Msb2 Vorläuferproteins war dabei unabhängig von den sekretorischen Aspartylproteinasen Sap9 und Sap10, sowie der Subtilisin-ähnlichen Serinprotease Kex2. Durch Analysen verschiedener Msb2-Varianten wurde eine Sequenz identifiziert, die essentiell für die Spaltung und Sekretion des Glykoproteins, sowie für alle Msb2-abhängigen Phänotypen ist. Die Ergebnisse zeigten, dass die Phosphorylierung und die damit verbundene Aktivierung der MAPK Cek1 von drei unterschiedlichen Msb2-Bereichen reguliert wird: in ungestressten Zellen reprimieren N-terminale Sequenzen die Cek1-Phosphorylierung, während diese bei Zellwandstress über Sequenzen im Cytoplasma und Bereiche flankierend zur Transmembrandomäne stimuliert wird. Weitere Sequenzen waren für die basale Resistenz gegen Antimykotika, die Regulation des PMT1-Transkriptspiegels und die Hyphen-Morphogenese erforderlich. Die Deletion von zwei Dritteln der Exodomäne führte zu einem hyperfilamentösen Phänotypen, welcher von dem Membranprotein Sho1, der MAPK Cek1 und dem Transkriptionsfaktor Efg1 abhängig war. Bei Zellwandschädigungen konnte weiterhin die Translokation der cytoplasmatischen Msb2-Domäne in das Cytoplasma und teilweise in den Kern nachgewiesen werden. Das Fehlen der cytoplasmatischen Region in Msb2 führte zu einer veränderten transkriptomalen Regulation von 117 Genen. Dieses Ergebnis zeigt, dass die cytoplasmatische Msb2-Domäne eine aktive Rolle bei der transkriptionellen Zellwand-Stressantwort spielt. Eine wichtige Verteidigungsstrategie des Wirts gegen C. albicans besteht in der Produktion von antimikrobiellen Peptiden (AMPs). AMPs sind Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems mit direkter antimikrobieller Funktion. Die Produktion von Msb2 war für die basale Resistenz von C. albicans gegen AMPs erforderlich. Die anschließende Charakterisierung der Interaktion des Msb2-Proteins mit verschiedenen AMPs (LL-37, Histatin 5, hBD1 und hNP-1) zeigte, dass das sekretierte Msb2-Protein als Schutzprotein gegen AMPs fungiert. Die schützende Wirkung von Msb2 war nicht auf proteolytischen Abbau der AMPs, sondern auf eine direkte hoch-affine Bindung von AMPs an die Msb2-Exodomäne (KD =73 nM) zurückzuführen. Die Schutzfunktion von Msb2 war abhängig von dessen Konzentration, sowie der durch Pmt1-vermittelten O-Glykosylierung von Msb2. Infektionskrankheiten werden oft nicht durch eine, sondern mehrere interagierende mikrobielle Spezies verursacht. Diese Interaktionen bewirken Antibiotika-Resistenzen, sowie eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Immunkomponenten. Es wurde festgestellt, dass das von C. albicans sekretierte Msb2 nicht nur Pilz-Zellen, sondern auch Bakterien vor der antimikrobiellen Wirkung von AMPs schützt. Auch das klinisch relevante Reserve-Peptidantibiotikum Daptomycin wurde durch Msb2 blockiert und schützte dadurch pathogene Bakterien in Ko-Kulturen und polymikrobiellen Biofilmen. Somit begünstigt das Msb2-Protein nicht nur das Überleben von C. albicans, sondern auch von begleitenden bakteriellen Pathogenen im Menschen und erschwert die antibiotische Therapie. The facultative pathogenic yeast Candida albicans has the ability to adapt to changing conditions in the human host. The sensor protein Msb2 in the plasma membrane detects cell wall alterations and regulates subsequently morphogenesis, cell wall biogenesis and stress resistance via the Cek1 mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. Hereby, the pathogen is able to compensate defects, which are caused by activities of the human immune system. C. albicans strains that produce a double epitope-labeled Msb2 variant, quantitatively secreted the extracellular domain into medium, while the cytoplasmic domain remained within the cell. The shed exodomain was highly O-glycosylated by protein mannosyltransferases Pmt1 and Pmt2 leading to a molecular mass of > 400 kDa. The proteolytic processing of the Msb2 precursor protein was independent of the secreted aspartyl proteases Sap9 and Sap10, and the subtilisin-like protease Kex2. Analyses of different Msb2 variants identified a sequence, which is essential for cleavage and secretion of the glycoprotein, as well as for all Msb2-dependent phenotypes. The results showed that phosphorylation of the MAP kinase Cek1 is regulated by three distinct Msb2 regions: in unstressed cells, N-terminal sequences repress Cek1 phosphorylation, while its induction under cell wall stress require the cytoplasmic tail and sequences flanking the transmembrane region. Further Msb2 sequences were required for basal resistance to antifungals, the regulation of PMT1 transcript levels, and for hyphal morphogenesis. The deletion of two-thirds of the exodomain induced a hyperfilamentous phenotype, which depended on the presence of the Msb2 interacting protein Sho1, MAPK Cek1 and the Efg1 transcription factor. During cell wall damage the cytoplasmic Msb2 domain was shown to become translocated to the cytoplasm and partially to the nucleus. Deletion of the cytoplasmic region in Msb2 led to transciptomal regulation of 117 genes. This result indicates that the cytoplasmic domain of Msb2 has an active role in the transcriptional response to cell wall stress. An important defense mechanism of the host is the production of antimicrobial peptides (AMPs). AMPs are effector molecules of the innate immune system with direct antimicrobial function. The production of Msb2 was required for the basal AMP resistance. The subsequent characterization of the interaction of the Msb2 protein and various AMPs (LL-37, Histatin 5, hBD1 and hNP-1) revealed that the shed Msb2 acts as a protectant against AMPs. The protective action is not due to proteolytic degradation of AMPs but depends on direct high-affinity binding to the Msb2 exodomain (KD =73 nM). The protective function of Msb2 depended on its concentration and Pmt1-mediated O-glycosylation of Msb2. Many infectious diseases are not caused by a single but multiple interacting microbial species. These interactions provide antibiotic resistance and reduced susceptibility to components of the immune system. It was found that the shed Msb2 protects fungal and bacterial cells against the antimicrobial activity of AMPs. Futhermore, the clinically relevant reserve peptide antibiotic daptomycin was blocked by Msb2 and protected pathogenic bacteria in co-cultures and polymicrobial biofilms. Thus, the Msb2 protein not only favors the survival of C. albicans but also of accompanying bacterial pathogens in the human host, thereby interfering with antibiotic therapy.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	19.06.2015
Dateien geändert am:	19.06.2015
Promotionsantrag am:	03.03.2015
Datum der Promotion:	09.06.2015